СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ НА ОСНОВЕ МАРКЕРА АПОПТОЗА Bax

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ НА ОСНОВЕ МАРКЕРА АПОПТОЗА Bax


RU (11) 2208790 (13) C1

(51) 7 G01N33/50, G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.07.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002128702/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.10.28 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.10.28 
(45) Опубликовано: 2003.07.20 
(56) Аналоги изобретения: HUNGERFORD J. Prognosis in ocular melanome. Br.j. Opthalmol., 1989, Sept. 73(9), pp.689-690. RU 2146823 C1, 20.03.2000. RU 2157998 C1, 20.10.2000. RU 2149404 C1, 20.05.2000. US 4507391 A, 26.03.1985. JP 59090052 A, 25.07.1984. 
(71) Имя заявителя: Лихванцева Вера Геннадьевна 
(72) Имя изобретателя: Лихванцева В.Г.; Степанова Е.В.; Сутулов А.Ю.; Астахова С.Е. 
(73) Имя патентообладателя: Лихванцева Вера Геннадьевна 
(98) Адрес для переписки: 109390, Москва, ул. Люблинская, 47, кв.254, В.Г.Лихванцевой 

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ НА ОСНОВЕ МАРКЕРА АПОПТОЗА Bax 

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Способ позволяет повысить точность и объективизацию прогнозирования клинического течения увеальной меланомы. С помощью иммуногистохимического анализа клеток удаленной опухоли определяют процент клеток, экспрессирующих Вах, по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения и при их наличии 20% и более прогнозируют вероятность метастазирования в 80% случаев. 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования клинического течения увеальной меланомы с целью назначения своевременного адекватного лечения, а следовательно, и увеличения продолжительности и улучшения качества жизни этого тяжелого контингента больных.

Увеальная меланома (УМ) - чрезвычайно злокачественная опухоль органа зрения, представляющая угрозу не только зрению, но и жизни пациента. Частота заболеваемости УМ по данным различных авторов колеблется от 2, 3 до 7 человек на 1 млн населения. Частота метастазирования после энуклеации достигает 80% при 10-летнем сроке наблюдения [Opthalmic Pathology and Intraocular Tumors. -1996-1997-р. 186-190. American Academy of Ophthalmology. San-Francisco].

Непредсказуемость этой опухоли позволяет отнести ее к разряду самых загадочных биологических феноменов. Метастазы могут развиться в отсутствие первичного опухолевого узла спустя 42 года после энуклеации или на фоне плоского полностью регрессировавшего первичного узла и т.д. Вопросы прогнозирования УМ занимали умы офтальмологов еще на рубеже 18-19 веков. Справедливости ради следует отметить, что многие из прогностических критериев, найденных более сотни лeт назад эмпирическим путем, с успехом используются в клинической практике и поныне. Так, в руководстве по офтальмологии проф. А. Фоссиуса написано, что прогноз заболевания зависит скорее от возраста пациента, нежели от стадии заболевания, на которой оно диагностировано и на которой удален больной глаз. При этом Фоссиус обращает внимание на тот факт, что наличие признаков экстраокулярного роста УМ резко сокращает шансы больного на выживание (Руководство по офтальмологии./Под ред. проф. A. Fossius, 1903 г. - С.-Петербур.]. По статистике другого офтальмолога - Fuchs - чаще метастазируют УМ "мелкоклеточного (имелось в виду эпителиоиодного) строения, чем опухоли, состоящие из веретенообразных клеток". Вторым критерием прогноза автор признавал степень обогащенности стромы УМ сосудами: "Богатые сосудами опухоли дают самое неблагоприятное предсказание, они растут быстрее всего и по статистике чаще ведут к рецидивам и метастазам." [Учебник глазных болезней. -Э.Фукс - перевод с немецкою издания под ред. проф. В.П. Одинцова и С.А. Бахмутовой. Москва. - Мед. издательство. - 1932, - с. 390-412].

На сегодняшний день официально признаны 16 клинико-морфологических критериев прогноза УМ. Основными являются: размеры, локализация, тип гистолического строения опухоли, степень склеральной инвазии, наличие или отсутствие очагов эпибульбарного роста, факт соприкосновения края опухоли с ДЗН или факт pacпространения переднего края опухоли кпереди за экватор, присутствие субретинальной жидкости, характер или тип ангиогенеза. показатели клеточной пролиферации (например, митотический индекс), возраст пациента, количество и состав тумор-инфильтрирующих лимфоцитов в строме УМ, присутствие генетических аберраций: характер и спектр экспрессии меланома-ассоциированных антигенов, уровень экспрессии активаторов и ингибиторов плазминогена и уровень их рецепции [Вedikian A.Y.. Legha S.S., Mavligit G. Treatment of uveal melanoma mеtastatic to the liver: a review of the M.D. Anderson Cancer Center experience and prognostic factors. // Cancer. -1995 -vol.76 -p.1665-1670]. Чувствительность и специфичность каждого из прогностических критериев и их различных комбинаций колеблется от 40 до 76% [там же]. Это означает, что при отборе пациентов с УМ в группe высокого риска развития метастазов по указанным критериям последние практически разовьются только у каждого второго.

Тип клеточного строения УМ высоко коррелирует с прогнозом заболевания. Мы взяли способ определения гистоморфологического типа строения опухоли за ближайший аналог предлагаемого нами способа прогнозирования. Он имеет свои преимущества и недостатки. Так, увеличение количества эпителиоидных клеток в строме смешанно-клеточных меланом значительно ухудшает их прогноз [Hungerford J. Prognosis in ocular melanoma //Br.J. Opthalm. -1989 -Sept. 73(9), -p. 689-690. Mooy CM.. De Yong PTVM. Prognostic parameters in uveal melanoma: a review. Surv. Opthalmol 1996 41: 215-228]. Отбор больных в группу риска развития метастазов среди пациентов с эпителиоидно-клеточными меланомами существенно затруднен, поскольку все они объединены по сходным критериям риска. Таким образом, достоверность и информативность официально признанных прогностических тестов оставляет желать лучшего. В целом проблема прогноза УМ далека от разрешения.

Между тем, исследования последних лет показали, что существенную помощь в прогнозировании могут оказать молекулярно-биологические маркеры, регулирующие основные биологические процессы в клетке, например апоптоз.

Известно, что биологическое поведение опухоли определяется балансом двух диаметрально противоположных по смыслу процессов - пролиферации и апоптоза.

Апоптоз - генетически программированный клеточный суицид. обеспечивающий количественный гомеостаз конкретной клеточной популяции.

Апоптоз - физиологический механизм регуляции клеточного гомеостаза тканей и органов в процессе эмбриогенеза, постнатального развития, инволюции. Ежедневно в организме человека через апоптоз умирает около 100 миллиардов клеток, что за 1,5-2 года приравнивается в общей массе к весу взрослого человека.

Апоптоз и ею нарушения лежат в основе развития многих патологических процессов, в том числе злокачественных опухолей. В запуске апоптоза участвуют биохимические, морфологические, иммунологические и функциональные сигналы-индукторы. Их комбинации варьируют в различных клетках, органах и тканях в разных физиологических и патологических условиях.

В опухолях человека апоптоз может быть спонтанный или индуцированный (лекарственный, лучевой, гормональный и т.д.).

Необходимо иметь четкие представления о том, что физиологический апоптоз, то есть протекающий в нормальных клетках, имеет принципиальные отличия от апоптоза опухолевых клеток. В последнем случае меняются не только его функции, но и механизмы регуляции. Если физиологический апоптоз - это механизм поддержания гомеостаза (объема органа, ткани и т.д.), а также генетического постоянства, то апоптоз в опухоли - один из способов иммортализации (закрепления) и усиления злокачественного фенотипа опухолевой клетки, его агрессивности, метастатического потенциала, а также регулятор скорости прогрессирования.

Спонтанный апоптоз изучен во многих типах опухолей человека. Его интенсивность зависит от гистогенеза опухоли, ее локализации, гистологического типа, стадии, гормонального статуса и ряда других факторов, каждый из которых или их комбинации оказывают различное влияние на развитие апоптоза.

В большинстве опухолей отмечена прямая корреляция между интенсивностью спонтанного апоптоза и активностью пролиферации. Опухоли с высокой пролиферативной активностью обладают более высокой способностью к апоптозу. Это объясняется тем, что клетки, находящиеся в 0-фазе и не входящие в цикл, то есть не пролиферирующие, не апоптируют. Апоптоз развивается только в клетках, находящихся и цикле пролиферации. При этом имеет значение не индекс митоза или индекс апаптоза как самостоятельный показатель, а баланс этих двух диаметрально направленных процессов: с одной стороны, пролиферации (увеличение клеточной популяции), с другой - апоптоза (гибель опухолевых клеток). Именно баланс этих двух механизмов гомеостаза клеточной популяции в итоге определяет скорость роста опухоли [Программированная клеточная гибель. - под редакцией Новикова В.С. - Санкт-Пeтepбуpг. - Наука, - с.30].

На широком спектре опухолей человека доказано, что интенсивность апоптоза прямо ассоциируется с прогрессированием, снижением степени зрелости и повышением агрессивности [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю.). Гибель клетки. -Москва. - Медицина. - 2001, - с. 189]. Многие авторы пришли к выводу, что интенсивность апоптоза является надежным прогностическим маркером. Чем он выше, тем выше злокачественный потенциал и хуже прогноз.

Апоптоз включается действием множества внутренних и внешних факторов [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки. -Москва. - Медицина. - 2001, - с. 189; Програмированная клеточная гибель. - под редакцией Новикова В.С. -Санкт-Петербург. - Наука, -с. 30] . Решение о запуске программы клеточной смерти определяется балансом про- и антиапоптических сигналов. Сигналы, помогающие клетке выжить, запускаются контактами клетка-клетка, клетка-экстрацеллюлярный матрикс, растворимыми ростовыми факторами [Bock E. Cell-cell adhesion molecules. // Biochеm. Soc. Trаns -1991 -vо1.19 - 2 -р.1076-1080. Bosman F.T. Integrins: cell adhesives and modulators of cell function. // Histochem. J. -1993 -vol.25 - 2 -p.469-477). В качестве примера растворимых внешних проапоптических сигналов могут служить CD95L [Griffith T.S., Brunner T. , Fletcher S.M. Fas-Ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. // Science.1995 -vоl.270 - 7 -р.1189-1192. Griffith T.S., Herndon J.M.. Green D.R. Ferguson T.A. CD95 induced apoptosis in lymphocytes in an immune privileged site induces immunological tolerance.// Immunity. -1996 -vоl.5- 1-р.7-16]. Внутри клетки решение о смерти определяется балансом между проапоптическими молекулами, подобными Вах, и антиапоптическими пептидами, например Всl-2. Способностью подавлять апоптоз при повреждениях ДНК обладает белок р53.

Для оценки апоптоза и основных механизмов, ответственных за его развитие, в практическом плане широко используются маркеры ключевых точек генетической программы клеточной смерти: протеинов р53, Bcl-2, Bax. Fas (AРO-l/CD-95). Из этого числа можно исследовать отдельные показатели, некоторые их сочетания или весь комплекс в зависимости от поставленных задач.

В мире существует немного публикаций об экспрессии Вах в опухолях вообще и меланоме, в частности, однако литературные данные противоречивы. Одни авторы указывают, что в первичной и метастатической меланоме кожи, как и в невусах, имеет место гиперэкспрессия Вах. Другие исследователи находят гиперэкспрессию Вах только в первичных меланомах (Tang L, Tron VA, Reed JC. Mah KJ, Krajewska M, Li G, Zhou X, Ho VC, Trotter MJ. Expression of apoptosis regulators in cutaneous malignant melanoma. Clin Cancer Res 1998; 4(8): 1865-71] . He установлено связи экспрессии Вах с прогнозом кожных меланом. В то же время доказано для больных раком молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, что экспрессия Вах является благоприятным прогностическим признаком. Мы предположили, что Вах - индуктор апоптоза - даст нам искомую информацию и об увеальной меланоме.

Для этого нами были проведены собственные исследования. В исследование включен 81 больной УМ, получивший хирургическое лечение (энуклеацию, блокэксцизию, экзентерацию) в институте глазных болезней им. Гемгольца (Москва) в период между 1982-1999 гг. 13 меланом (16%) локализовались в заднем полюсе, 5 (6,2%) в постэкваториальной зоне, 9 меланом (11,1%) были цилиарной локализации, 5 (6,2%) - иридоцилиарной и 23 (28,4%) распространялись от цилиарного тела до постэкватора. 26 меланом (32,1%) были обширными, с неустановленной первичной локализацией. При анализе данных опухоли были разделены по размеру на средние (высота 2,5-10,0 мм, диаметр 5,0-16,0 мм) и большие (высота > 10,0 мм, диаметр > 16 мм). В исследовании отсутствовали малые меланомы (высота 1,0-2,5 мм, диаметр < 5 мм). Все меланомы были верифицированы гистологически с определением типа клеточного строения УМ согласно классификации Callendar. 31 больной (38,3%) имели веретеноклеточный тип опухоли, 15 больных (18,5%) - эпителиоидный и 35 (43,2%) - смешанный тип УМ. У 8 больных (9,9%) наблюдался экстраокулярный выход. Очаги некрозов в ткани опухоли были обнаружены в 10 (12,3%) из 80 случаев (в одном случае информация о наличии очагов некроза в опухоли была недоступна).

После забора операционного материала последний был заключен в парафиновые блоки по стандартной методике и проанализирован иммуногистохимически на присутствие Вах.

Статистический анализ данных был проведен с использованием the SPSS statistical software (SPSS Advanced Statistics, Release 10.0.05., SPSS Inc, 1999). Для статистического анализа корреляций между гиперэкспрессией белка и различными клинико-патологическими параметрами использовали 2-критерий. Безрецидивная и общая выживаемость были оценены с использованием метода Каплан-Майера. Log-rank-тест служил для оценки достоверности различий в сравниваемых группах. Прогностическая значимость данных оценивалась с помощью регрессионного анализа Сох. Значение р<0,05 рассматривалось как значимое.

Проведенные нами исследования являются по сути первыми по изучению роли экспрессии Вах в УМ. Экспрессия Вах выявлена в 35% тестируемых опухолей. Не обнаружено корреляций между экспрессией Вах и традиционными клинико-патологическими характеристиками опухоли.

Вместе с тем было обнаружено, что низкая общая выживаемость наблюдалась у больных, положительных по Вах, по сравнению с Вах-отрицательной группой (р= 0.022: чертеж, В).%. При анализе все пациенты были распределены на две группы А и В. Группу А образовали 61 пациент с Вах-негативными больными, из которых за время наблюдения (209.63.3 месяца) умерло от генерализации процесса 10 человек. Группу В составили 33 пациента с Вах-позитивными УМ, из которых умерло 13 человек от метастического процесса при средних сроках наблюдения 89.89.3 месяца. Специфика построения кривых выживаемости в группах очевидна: выживаемость в группе А при 10-летнем сроке наблюдения составила 80%, а в группе В при тех же сроках наблюдения в два раза меньше (40%, р<0.01). Медиана продолжительности жизни с момента оперативного вмешательства до смерти от метастазов составила 81 месяц. При оценке безрецидивной выживаемости выявлена сильная тенденция к более частому развитию метастазов у Вах-положительных больных по сравнению с Вах-отрицательными больными (р= 0.061: чертеж, А). Медиана времени до появления метастазов в группе Вах-позитивных больных составила 72 мес.

Полученные результаты позволяют предположить, что этот белок играет важную роль в прогрессировании УМ, поскольку безрецидивная и общая выживаемость у Вах-отрицательных больных значительно выше, а разница в показателях выживаемости в обеих анализируемых группах высоко достоверна (р=0.02).

Таким образом, результаты проведенных нами исследований позволяли прийти к заключению, что количественное определение экспрессии Вах в УМ может служить высоко достоверным и информативным маркером прогнозирования клинического течения УМ.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, в частности, вероятность развития метастазов у каждого конкретного больного.

Техническим результатом является объективизация и повышение точности прогнозирования.

Технический результат достигается за счет иммуногистохимического анализа удаленной опухоли с точным определением количественных показателей экспрессии Вах в собственно опухолевых клетках увеальной меланомы.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После энуклеации глаза с увеальной меланомой готовят парафиновые срезы толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинируют в ксилоле и регидратируют в батарее спиртов.

2. Иммуногистохимическое исследование проводят по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводят обработку срезов в нитратном буфере [pH 6.0] в течение 30 минут при 95oС на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводят в течение ночи при 4oC. Для визуализации реакции антиген-антитело используют стрептавидин-биотиновую тест-систему LSAB+kit [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена используют ДАБ+ [DAKO Corp].

4. Затем срезы докрашивают гематоксилином и заключают в бальзам.

В качестве первичных антител используют кроличьи поликлональные антитела к Вах (разведение 1:500, DAKO Corp).

5. Реакцию оценивают с применением светового микроскопа (увеличение х 40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивают в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля используют иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

6. Количественную оценку экспрессии маркера по срезу определяют как долю иммунопозитивных клеток от общего числа клеток в поле зрения микроскопа х 40. В случае, где процент позитивных не превышал 20%, реакция расценивалась как слабая. Если процент позитивных клеток был больше 20%, реакция считалась выраженной.

7. При выявлении более 20% позитивных клеток в УМ считают прогноз для конкретно пациента с таким показателем в плане клинического течения увеальной меланомы неблагоприятным с короткой продолжительностью жизни и вероятностью метастазирования 80%. Пациента выделяют в группу риска и проводят профилактическое лечение.

Пример 1. Пациент 65 лет. Диагноз УМ в стадии Т3NоМо. Размеры опухоли не позволяли провеет органосохранное лечение. Безальтернативным методом являлась энуклеация. Иммуногистохимические исследования парафинового среза опухоли по указанному способу выявили 55% Вах-позитивных клеток на срезе УМ при увеличении х 40. Больной отнесен в группу высокого риска развития метастазов. Назначены укороченные интервалы между визитами врача. Незадолго до окончания года наблюдения после энуклеации у больного выявлены метастазы в печени. Проведена иммунотерапия с целью замедления скорости метастазирования.

Пример 2. Пациентка 73 лет. Перенесла энуклеацию по поводу УМ значительных размеров. Размеры, локализация, возраст являлись факторами высокого риска развития метастазов. Однако проведенные исследования по определению уровня Вах показали, что белок синтезируется лишь в 5% опухолевых клеток. Наблюдение на протяжении 8 лет не выявило вторичных очагов УМ.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с достоверной степенью точности прогнозировать клиническое течение увеальной меланомы после энуклеации и назначать своевременное адекватное лечение, позволяющее в ряде случаев профилактировать, а в ряде отдалить развитие метастатического процесса. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, отличающийся тем, что с помощью иммуногистохимического анализа клеток удаленной опухоли определяют процент клеток, экспрессирующих Вах, по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения, и при их наличии 20% и более прогнозируют вероятность метастазирования в 80% случаев.