СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙОМИОМЫ ОТ МЕЛАНОМЫ РАДУЖКИ

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙОМИОМЫ ОТ МЕЛАНОМЫ РАДУЖКИ


RU (11) 2199124 (13) C1

(51) 7 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 19.06.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001113694/14 
(22) Дата подачи заявки: 2001.05.23 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.05.23 
(45) Опубликовано: 2003.02.20 
(56) Аналоги изобретения: SHIELDS J.A. et al. Fine needle aspiration biopsy of suspected intraocular tumors. Ophthalmology, 1993, vol. 95, p.1251-1255. RU 2147129 C1, 27.03.2000. RU 2149404 C1, 20.05.2000. RU 2088940 C1, 27.08.1997. RU 96100896 A, 27.03.1998. 
(71) Имя заявителя: Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца 
(72) Имя изобретателя: Лихванцева В.Г.; Степанова Е.В. 
(73) Имя патентообладателя: Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца 
(98) Адрес для переписки: 103064, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца 

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙОМИОМЫ ОТ МЕЛАНОМЫ РАДУЖКИ 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для диференциальной диагностики лейомиом от меланом радужки. Проводят исследование уровня ФНО в слезной жидкости больного глаза. При выявлении этого показателя на уровне более или равном 140 пкг/мл диагностируют лейомиому, а при уровне ниже 140 пкг/мл констатируют меланому радужки. Способ позволяет определить адекватную лечебную тактику. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для проведения дифференциальной диагностики двух сходных по клинической картине опухолей радужки: меланомы и лейомиомы.

Меланома радужки представляет собой злокачественную меланоцитарную опухоль, исходящую из стромы радужной оболочки. Клинически ее описывают, как растущую диффузно или узлом от интенсивно-пигментированной до амеланоцитарной опухоли. Лейомиома радужки составляет по данным Ashton 14,3%, а по данным Пачес А.И. - 53,7%. Клинически лейомиома может иметь три формы: узловую, плоскостную, смешанную [Shields J.A., Shields C.L. Intraocular tumors. A text and atlas.-Philadelphia- W.B. Saunders.-1992-p.69-77].

Не существует патогномоничных признаков для лейомиомы или меланомы. И та и другая опухоль при поздних обращениях вызывает сходные вторичные изменения в глазу, типа вторичной глаукомы или осложненной катаракты [Rones В., Zimmerman L.Е. The production of heterochromia and glaucoma by diffuse malignant melanomas of the iris. Trans Am. Acad Ophthalmol. Otolaryngol -1957-vol. 61-p. 447-463] . Однако подходы к лечению этих двух опухолей принципиально отличаются: при лейомиоме делают блокэксцизию в пределах видимых границ опухоли, а при меланоме объем оперативного вмешательства расширяют, в ходе операции используют все существующие правила абластики [Shields J.A., Shields C. L. , de Potter P. Treatment of nonresectable malignant iris tumors with custom design plaque radiotherapy.- Br. J. Ophthalmology, 1995, vol. 79, p. 306-312, Shields J.A., Shields C.L. Surgical management of iris melanoma. In Roy FD ed. Master techniques malignant iris tumors with custom designed plaque radiotherapy. - Br J. Ophthalmology, 1995, vol. 79, p. 306-312], поскольку они частично гарантируют от генерализации и рецидивов процесса, которые хотя и более редко при меланомах этой локализации, но все-таки развиваются в 10 и 40% случаях, соответственно [Zimmerman L.E. Clinical Pathology of iris tumors.- The Ward burdick Award Contribution -Am. J. Clin. Pathol 1963, vol. 39, p. 214-228]. Ряд ведущих офтальмоонкологов мира указывает на необходимость точной предоперационной диагностики [Shields J.A., Shields C.L. Intraocular tumors. A text and atlas.-Philadelphia- W.B. Saunders, 1999, p. 22]. Однако традиционные УЗ-исследования и более современная биомикроскопия глаза позволяют определить степень протяженности процесса и отдифференцировать кисту, например, от опухоли, но не позволяет различить лейомиому от меланомы радужки. В трудных случаях тонкоигольная аспирационная биопсия может помочь в диагностике, однако в ряде случаев (40%) и она бессильна [Shields J.A., Shields C.L., Ehya H., Eagle R.C. Fine needle aspiration biopsy of suspected intraocular tumors. - Ophthalmology. -1993-vol. 95-p. l251-1255]. Третьим вспомогательным способом, позволяющим провести дифференциальную диагностику, является флоуоресцентная ангиография с флуоресцеином. Однако этот инвазивный способ имеет ограниченное применение из-за противопоказаний у лиц с повышенной чувствительностью, аллергиков, при болезнях кровеносной и венозной систем. К тому же в ряде случаев по неизвестным причинам возможны как ложно положительные, так и ложно отрицательные случаи.

В ходе проведения иммунологических исследований у 152 больных с увеальными меланомами различных локализаций, включающих оценку системного и местного цитокинового статуса, нами было параллельно в качестве группы сопоставления обследовано 20 пациентов лейомиомой. Все опухоли были впоследствии верифицированы гистологически. Было установлено достоверное отличие выявляемых уровней секреции ФНО в СЖ при этих опухолях. Так, если показатели в контроле (здоровых доноров) составляли 13,3% выявляемости на среднем уровне 11015 пкг/мл, то при лейомиоме - 80% выявляемости при среднем уровне - 18545 пкг/мл, а при меланоме радужки практически не повышался выше 84 пкг/мл при 11,3% обнаружении (р<0,05). Таким образом, полученные нами данные открывали возможность для использования их в качестве дополнительного аргумента при проведении предоперационной дифференциальной диагностики этих двух заболеваний.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики между двумя сходными по клинической картине офтальмоонкологическим заболеваниям: лейомиоме и меланоме радужки.

Технический результат предлагаемого способа состоит в возможности установления точного диагноза, определяющего дальнейшую адекватную лечебную тактику.

Технический результат реализуется за счет определения уровня ФНО в слезной жидкости больного глаза.

Способ осуществляется следующим способом.

Тест по выявлению ФПО- производится с помощью иммуно-ферментного анализа (используют коммерческие тест-системы для количественного определения ФНО- (например, "Протеинового контура, Санкт-Петербург, "Innogenetic", Бельгия).

Использованные нами тест-системы позволяли определить ФНО- в интервале концентраций 20-2000 пкг/мл.

Способ осуществляли следующим способом.

1. Забирают слезную жидкость с помощью микропипетки или пипетки для закапывания в количестве 100 кл в сухую пробирку Аппендорф. Всего при постановке ELISA на ФНО нужно не более 100 кл исследуемой пробы.

2. После двукратного промывания лунок планшета, вносят 300 мкл буфера соответствующего разведения, предоставляемого тест-системой фирмой-изготовителем, в каждую лунку, затем аспирируют слезную жидкость.

3. Растворяют содержимое ампул со стандартными препаратами, внося по 1 мл буфера для образцов в каждую лунку.

4. В ячейки планшета, предназначенные для пулевой пробы (Blank), вносят по 100 мкл буфера С. В ячейки планшета, предназначенные для калибровки значений, вносят по 100 мкл стандартов ФПО-.

5. В оставшиеся ячейки планшета вносят исследуемые образцы тест-объекта в объеме 100 мкл. Инкубируют 1 час при 37oС.

6. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером В (300 мкл на одну ячейку), проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

7. Пипеткой вносят в каждую лунку по 100 мкл раствора вторых антител (находящихся в тест-системе). Вновь инкубируют 1 час при 37oС.

8. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером R (300 мкл на одну ячейку). Вновь проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

9. Разбавляют необходимое для анализа количество в соотношении 1:10 конъюгата стрептовидина с пероксидазой хрена буфером С и вносят по 100 мкл раствора в каждую ячейку планшета.

10. Инкубируют 45 минут при 37oС.

11. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером В (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

12. Дважды промывают ячейки путем постукивания по поверхности стока, покрытого фильтровальной бумагой.

13. Вносят во все лунки по 100 мкл раствора субстрата с красителями.

14. Инкубируют планшет 15-30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Наблюдают развитие голубой окраски.

15. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора серной кислоты в каждую лунку.

16. Проводят учет результатов с использованием автоматического фотометра при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по нулевой лунке.

17. Строят калибровочную кривую - оптическая плотность/концентрация, пользуясь данными по концентрациям, указанным для растворов стандартов. По калибровочной кривой определяют графически концентрацию ФНО в образцах.

При выявлении концентрации, более или равной 140 пкг/мл, но менее 230 пкг/мл констатируют лейомиому, а при уровне ниже 140 пкг/мл - меланому радужки.

Пример 1. Б-ая С. , 45 лет. Случайно обнаружила у себя "пятно" на радужке. Обратилась к окулисту, который констатировал новообразование радужки и направил в МНИИ им. Гельмгольца. Диагноз подтвердили без уточнения опухоли. Была предложена блокэксцизия опухоли. В стационаре при дополнительном обследовании в слезной жидкости больного глаза не выявлен ФНО. Предположительный диагноз - меланома радужки. Оперативное вмешательство проведено в полном объеме. Гистологически диагноз меланомы был верифицирован.

Пример 2. Б-ой 27 лет. При проф. осмотре выявлена опухоль радужки, направлен на оперативное лечение в МНИИ им. Гельмгольца. Исследование слезной жидкости больного глаза позволило выявить ФНО на уровне 220 пкг/мл. Констатировали лейомиому радужки. Операцию проведи в экономном режиме, который позволил осуществить пластику радужки и зрачкового края с формированием зрачка. Эти мероприятия избавили пациента от постоперационных аберраций, хрусталикового астигматизма и косметического дефекта. Гистологически подтверждена лейомиома. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ дифференциальной диагностики между лейомиомой и меланомой радужки, отличающийся тем, что в слезе больного глаза определяют концентрацию ФНО и при его величине равной или более 140 пкг/мл, но менее 230 пкг/мл констатируют лейомиому, а при уровне ниже 140 пкг/мл - меланому радужки.