СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ


RU (11) 2304786 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/92 (2006.01)
G01N 33/84 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 25.10.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.08.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005112169/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.04.22 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.04.22 
(43) Дата публикации заявки: 2006.10.27 
(45) Опубликовано: 2007.08.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 2020861 C1, 15.10.1994. RU 2124727 C1, 10.01.1999. RU 2071059 C1, 27.12.1996. SU 938997 A1, 30.06.1982. SU 1679381 A1, 23.09.1991. SIEMIANOWICZ К et al. Blood antioxidant parameters in patients with diabetic retinopathy. Int J Mol Med. 2004 Sep; 14(3);433-7, PMID 15289896, (реферат), [он-лайн] [13.07.2006], найдено из БД PubMed. 
(72) Имя изобретателя: Экгардт Валерий Федорович (RU); Ковалев Виталий Юрьевич (RU); Орлова Наталия Сергеевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования (RU) 
(98) Адрес для переписки: 454021, г.Челябинск, пр. Победы, 287, УГМАДО, Библиотека 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в диагностике диабетической ретинопатии. Сущность способа диагностики диабетической ретинопатии заключается в том, что путем биохимических исследований слезной жидкости (СЖ) определяют концентрацию холестерина, активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, в крови определяют концентрацию нитритов, на основании полученных показателей рассчитывают Function 1 и Function 2. Function 1 = -3,4 + 0,29(NO2) + 32,5(холестерин) - 0,97(каталаза) - 17,28(СОД) - соответствует значению по оси ординат и Function 2 = -7,14 + 0,17(NO2 ) + 37,2(холестерин) + 2,1(каталаза) - 3,15(СОД) - соответствует значению по оси абсцисс на карте для определения типа поражения. При попадании полученной точки на поле 1 карты определяют наличие у пациента непролиферативной формы ДР без угрозы пролиферации; на поле 2 - непролиферативной формы ДР с угрозой пролиферации; на поле 3 - пролиферативной формы ретинопатии в фазе неоваскуляризации. Использование способа позволяет провести своевременную диагностику, дифференцировку в сомнительных случаях, направленную на адекватное лечение и снижение риска прогрессирования ДР. 1 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в диагностике стадий диабетической ретинопатии.

Известным аналогом метода прогнозирования развития диабетической ретинопатии (ДР) является выявление в слезной жидкости (СЖ) антител к S-антигену сетчатки. Согласно данному способу, установление в СЖ уровня антител с титром более 1/128 свидетельствует о развитии ДР (Зайцева Н.С., Слепова О.С., Ли Л.С., Дудникова Л.К. К иммунодиагностике диабетической ретинопатии. - Вестник офтальмологии. - 1990, №1, С.46-49). Данный способ позволяет прогнозировать лишь вероятность возникновения ДР и не дает возможности предположить риск развития определенной ее стадии.

Наиболее близким по технической сущности, достигаемому эффекту и выбранным в качестве прототипа является способ дифференциальной диагностики диабетической ретинопатии у больных с непрозрачными средами глаза при нормогликемии (RU 2020861, опубл. 15.10.1994).

Однако в указанном прототипе диагностика стадий ДР основана только на одном биохимическом показателе - концентрации глюкозы в слезной жидкости, который является довольно нестабильным, даже в течение суток, параметром.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является обеспечение возможности диагностики стадий развития ДР.

Технический результат - своевременная диагностика, дифференцировка в сомнительных случаях, направленная на адекватное лечение и снижение риска прогрессирования ДР.

Указанная задача решается за счет того, что в заявленном способе диагностики диабетической ретинопатии путем биохимических исследований, включающих исследование слезной жидкости, отличающийся тем, что в слезной жидкости определяют концентрацию холестерина, активность супероксиддисмутазы и каталазы, в крови определяют концентрацию нитритов, на основании полученных показателей рассчитывают Function 1 и Function 2;

Function1=-3,4+0,29(NO 2)+32,5(холестерин)-0,97(каталаза)-17,28(СОД) соответствует значению по оси ординат и

Function2=-7,14+0,17(NO 2)+37,2(холестерин)+2,1(каталаза)-3,15 (СОД) соответствует значению по оси абсцисс

на карте для определения типа поражения, при попадании полученной точки на поле 1 карты определяют наличие у пациента непролиферативной формы ДР без угрозы пролиферации; на поле2 - непролиферативной формы ДР с угрозой пролиферации; на поле3 - пролиферативной формы ретинопатии в фазе неоваскуляции.

К критериям статистически достоверно значимым по проведенным нами исследованиям относятся: нитриты периферической крови и холестерин, каталаза, СОД в СЖ.

Данные показатели определялись в биохимической лаборатории по нижеприведенным методикам.

Определение нитритов в периферической крови.

Определение проводили по методу Емченко Н.Л., Цыганенко О.И., Ковалевской Т.В. «Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма». Клиническая и лабораторная диагностика, 1994, №6, С.19-20.

По данной методике нитраты определяются в виде нитритов после восстановления их губчатым кадмием. Для определения фракции нитритов авторы предлагают аналогичный алгоритм исследования, но без пропускания через кадмиевую колонку.

В центрифужные пробирки вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл 50% сульфата цинка, 1,0 мл 17% раствора феррицианида железа, 1,0 мл анализируемой крови. Затем прибавляют 2,0 аммиачно-хлоридного буфера (рН=9,6) и 5,0 мл дистиллированной воды.

Отбирают аликвоту центрифугата объемом 5 мл в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2,5 мл аммиачно-хлоридного буфера, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают. Затем в колбу прибавляют 5 мл 0,25% раствора стрептоцида, 1 мл HCl (1/2) и через 5 мин - 1 мл 0,1% раствора НЭДА. Раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и оставляют на 10 мин. По истечении этого времени пробы фотометрируют на фотоэлектроколориметре КФК-3 при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр, в кювете с длиной оптического пути 5 см против холостой пробы.

Концентрацию нитритов определяют по градуировочному графику. Для его построения в мерные колбы вместимостью 50 мл вносят 0,25, 0,5, 1, 2,5 и 5 мл раствора нитрата калия с концентрацией нитрат-иона, равной 10 мкг/мл, что соответствует 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мкг/мл, добавляют по 10 мл дистиллированной воды и по 5 мл аммиачно-хлоридного буфера и элюируют через кадмиевую колонку. Оптическую плотность измеряют против холостого раствора.

Содержание нитритов (X, мг/л) в анализируемых образцах биосред рассчитывают по формуле

Х=C1×V1×V 2/V3×V4 ,

где C1 - концентрация нитрат-ионов в фотометрируемом растворе, найденная по градуировочному графику (в мкг/мл);

V1 - общий объем безбелкового экстракта (в мл);

V2 - общий объем фотометрируемого раствора (в мл);

V3 - объем образца, взятый для анализа (в мл);

V 4 - объем безбелкового экстракта, взятый для дальнейшего анализа.

Ферментативный метод количественного определения общего холестерина в слезной жидкости.

Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеидов под действием детергентов. Холестеринэстераза гидролизует эфиры холестерина, образующийся холестерин под действием холестериноксидазы окисляется. В процессе реакции образуется индикатор кинонимин из перекиси водорода и 4-аминофеназона в присутствии фенола и пероксидазы.

Эфир холестерина + Н2О - холестеринэстераза холестерин+жирная кислота.

Холестерин + О 2 - холестериноксидаза (CHOD) холестен-3-он+Н2О 2

2 Н2O2 +4-аминофеназол+фенол - пероксидаза кинонимин + 2 Н2О

В кювету помещают бланк стандарт Проба 
Стандарт - 10 мкл - 
Проба - - 10 мкл 
Рабочий реагент 250 мкл 250 мкл 250 мкл 


Перемешать.

Инкубировать 5 минут при температуре 37°С и 10 минут при 15-25°С.

Измерить оптическую плотность проб и стандарта относительно бланка по реагенту при длине 540 нм на анализаторе ФП 901М (Финляндия).

Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации холестерина.

Определение каталазы.

Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Для определения активности каталазы к 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода добавляли 0,02 мл слезы. В холостую пробу вместо слезы вносили 0,02 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением 0,5 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски замеряли спектрофотометрически при длине волны 410 нм относительно холостой пробы. Активность каталазы рассчитывали по формуле

А=(Ехол-Еоп)×V×t×K;

где А - активность каталазы в мккат/мл,

Ехол и Еоп - экстиции холостой и опытной проб,

V - объем вносимой пробы

t - время интубации (600 сек),

К - коэффициент миллимолярной экстиции перекиси водорода 22,2×10 мккат/мл.

Определение концентрации супероксиддисмутазы.

Определение проводили по методу Е.В.Макаренко. «Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах у больных с хроническими заболеваниями печени», Лабораторное дело, №11, 1988, с.48-49.

Для определения активности СОД 20 мл слезы вводили в 1 мл инкубирующей среды, содержащей 0,41 мМ нитросинего тетразолия, 0,33 мМ ЭДТА, 0,01 мМ N-метилфеназолия метилсульфата. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм, затем добавляли в микрокювету спектрофотометра 0,1 мл 0,8 мМ НАДН, перемешали и оставляли в темноте на 10 мин. После чего повторно измеряли оптическую плотность. О реакции судили по разнице между первым и вторым показателями спектрофотометра. Активность фермента выражали в условных единицах.

Обследовано 60 пациентов, все они имели второй тип сахарного диабета, у 12 выявлена непролиферативная стадия ДР без угрозы пролиферации, у 24 непролиферативная стадия ДР с угрозой пролиферации и у 24 пролиферативная стадия ретинопатии в фазе неоваскуляризации. Использована классификация В.Ф.Экгардта, 1997 год. Возраст пациентов составил от 44 до 71 года, 15 мужчин и 45 женщин.

На основании дискриминантного анализа была построена карта и определена функциональная зависимость влияния факторов на прогнозирование развития ДР.

Для пользования данной картой необходимо по формуле Function 1 рассчитать значение, исходя из имеющихся данных биохимических исследований, и отметить это значение по оси абсцисс. Затем подобные вычисления производятся для Function 2, полученное значение отмечается по оси ординат. Попадание точки, полученной благодаря перекресту этих значений, на одно из трех полей карты и определяет наличия у пациента данного типа поражения с вероятностью 96,7%.

1. непролиферативная форма ДР без угрозы пролиферации.

2. непролиферативная форма ДР у угрозой пролиферации,

3. пролиферативная форма ретинопатии в фазе неоваскуляризации.

Function 1=-3,4+0,29 (NO2 крови)+32,5(холестерин слезной жидкости) - 0,97 (каталаза) - 17,28 (СОД).

Function 2=-7,14+0,17 (NO2 крови)+37,2(холестерин слезной жидкости)+2,1 (каталаза) - 3,15 (СОД).

Достоверность модели 96,7%.

Примеры

Пример 1. Игнатова Нина Васильевна, 66 лет, имеет сахарный диабет 2 типа в течение 8 лет, принимает манинил. Сопутствующие заболевания - гипертоническая болезнь 2 ст, 2 ст, 4 риск. Диабетическая ретинопатия выявлена на профосмотре в 2001 году.

Объективно - глазное дно OU: ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Вены расширены, извиты, калибр их неравномерен. Артерии частично склерозированы. В сетчатке единичные микроаневризмы, мелкоточечные геморрагии.

Лабораторно: нитриты периферической крови =26 мг/л,

Холестерин слезной жидкости =0,035 ммоль/л,

Каталаза =2,9 ммкат/мл и СОД=0,42 у.е./мл в СЖ.

Function 1=-3,4+0,29(26)+32,5(0,035)-0,97(2,9)-17,28(0,42)=-4,78

Function 2=-7,14+0,17(26)+37,2(0,035)+2,1(2,9)-3,15(0,42)=4,18

Это значит, что в карте данное значение расположится в первом секторе, что определяет его как ДР непролиферативной формы без угрозы пролиферации. Данный вывод согласуется с данными клинического осмотра и флюоресцентной ангиографией.

Пример 2. Герасименко Зинаида Андреевна, 66 лет, имеет сахарный диабет 2 типа в течение 11 лет, принимает диабетон. Сопутствующие заболевания - гипертоническая болезнь 2 ст, 2 ст, 4 риск. Диабетическая ретинопатия выявлена в 2000 году, проведена лазеркоагуляция по типу «решетки».

Объективно - глазное дно OU: ДЗН бледный, границы четкие. Вены расширены, извиты, калибр их неравномерен. Артерии склерозированы полностью, Salus III. В сетчатке единичные твердые, мягкие экссудаты, преретинальные кровоизлияния. В макулярной области диспигментация, периферично очажки хориоидоза после ЛК.

Лабораторно: нитриты периферической крови =35 мг/л,

Холестерин слезной жидкости =0,09 ммоль/л,

Каталаза =3,2 ммкат/мл и СОД=0,32 у.е./мл в СЖ.

Function 1=-3,4+0,29(35)+32,5(0,09)-0,97(3,2)-17,28(0,32)=1

Function 2=-7,14+0,17(35)+37,2(0,09)+2,1(3,2)-3,15(0,32)=7,8

Это значит, что в карте данное значение расположится во втором секторе, что определяет его как ДР непролиферативной формы с угрозой пролиферации. Данный вывод согласуется с данными клинического осмотра и флуоресцентной ангиографией.

Пример 3. Бажанова Людмила Ивановна, 54 лет, имеет сахарный диабет 2 типа в течение 16 лет, принимает инсулин в течение последних 3 лет. Сопутствующие заболевания - гипертоническая болезнь 2 ст, 2 ст, 4 риск., хронический пиелонефрит. Диабетическая ретинопатия выявлена в 2001 году.

Объективно - глазное дно OU: ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Вены расширены, извиты, калибр их неравномерен. Артерии склерозированы частично. В сетчатке множественные твердые, единичные мягкие экссудаты, мелкоточечные кровоизлияния. На правом глазу эпипапилярно, на левом перипапилярно и в сетчатке определяются новообразованные сосуды.

Лабораторно: нитриты периферической крови =40 мг/л,

Холестерин слезной жидкости =0,069 ммоль/л,

Каталаза =2 ммкат/мл и СОД=0,24 у.е./мл в СЖ.

Function 1=-3,4+0,29 (40)+32,5(0,069)-0,97(2)-17,28(0,24)=4,35

Function 2=-7,14+0,17(40)+37,2(0,069)+2,1(2)-3,15(0,24)=5,67

Это значит, что в карте данное значение расположится в третьем секторе, что определяет его как ДР пролиферативной формы. Данный вывод согласуется с данными клинического осмотра и флюоресцентной ангиографией.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ диагностики формы диабетической ретинопатии (ДР) путем биохимических исследований, включающих исследование слезной жидкости (СЖ), отличающийся тем, что в слезной жидкости определяют концентрацию холестерина, активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, в крови определяют концентрацию нитритов, на основании полученных показателей рассчитывают Function 1 и Function 2, Function 1=-3,4+0,29(NO 2)+32,5 (холестерин) - 0,97(каталаза) - 17,28(СОД) соответствует значению по оси ординат и Function 2=-7,14+0,17(NO 2)+37,2(холестерин)+2,1(каталаза) - 3,15(СОД) соответствует значению по оси абсцисс на карте для определения типа поражения, при попадании полученной точки на поле 1 карты определяют наличие у пациента непролиферативной формы ДР без угрозы пролиферации; на поле 2 - непролиферативной формы ДР с угрозой пролиферации; на поле 3 - пролиферативной формы ретинопатии в фазе неоваскуляризации.