СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ТОНЗИЛЛИТА

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ТОНЗИЛЛИТА


RU (11) 2188422 (13) C2

(51) 7 G01N33/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.08.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000133119/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.12.29 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.12.29 
(45) Опубликовано: 2002.08.27 
(56) Аналоги изобретения: ТЕТЕРИН Ф.Н. и др. К диагностике безангинных форм хронического тонзиллита. - Военно-медицинский журнал, 1983, № 9, с.54-55. RU 2160901 С1, 20.12.2000. RU 2014103 С1, 15.06.1994. 
(71) Имя заявителя: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН 
(72) Имя изобретателя: Бухарин О.В.; Усвяцов Б.Я.; Хуснутдинова Л.М. 
(73) Имя патентообладателя: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН 
(98) Адрес для переписки: 460000, г.Оренбург, ул. Пионерская, 11, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Б.Я.Усвяцову 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ТОНЗИЛЛИТА 

Изобретение относится к медицине. Способ осуществляется путем выделения из микрофлоры слизистой миндалин чистых культур S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков, приготовления их микробных взвесей и проведения перекрестного посева взвесей двух культур микробов-ассоциантов на плотную питательную среду с яичным желтком. Далее на ту же питательную среду проводят контрольные посевы этих же культур штрихом, инкубируют и изучают характер изменения лецитовителлазной активности (ЛецА) у выделенных микробов-ассоциантов путем измерения ширины зоны помутнения в опыте и контроле, при увеличении ее в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более хотя бы у одной культуры диагностируют хронический тонзиллит. Способ позволяет повысить точность диагностики и сократить ее сроки, особенно при безангинных формах хронического тонзиллита. 1 ил., 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики хронического тонзиллита и выявления его безангинных форм.

Известен способ диагностики безангинных форм хронического тонзиллита, основанный на определении величины эмиграции лейкоцитов на поверхности небных миндалин под действием преднизалона [1].

Недостатком данного способа является его сложность, т.к. проводится двукратный подсчет лейкоцитов под микроскопом в 16 больших квадратах, т.е. во всей камере Фукса-Розенталя. Кроме того, известный способ может быть использован у ограниченной группы людей, так как из-за необходимости внутримышечного введения гормона преднизалона нежелательно использование данного способа для детского организма.

Известен способ диагностики хронического тонзиллита путем сопоставления фарингоскопических признаков заболевания и общих его проявлений [2]. Согласно данному способу для хронического тонзиллита характерно поступление из лакун гнойного содержимого, часто в виде жидкого гноя или казеозных гнойных пробок, нередко с запахом. Наличие данного признака всегда следует трактовать как хроническое воспаление миндалин. Однако отсутствие такого признака еще не доказывает, что хронического тонзиллита нет, так как содержимое из лакун может уходить при проглатывании пищи.

Другим достоверным признаком хронического тонзиллита, согласно известному способу, считаются частые ангины в анамнезе в течение ряда лет (2-3 раза в год). Таким образом, к недостаткам способа также можно отнести длительность оценки (несколько лет). Кроме того, у 4-6% больных хроническим тонзиллитом ангины могут отсутствовать.

Заявляемый способ решает задачу создания нового эффективного способа диагностики хронического тонзиллита.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе диагностики хронического тонзиллита из микрофлоры слизистой миндалин выделяют чистые культуры S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков (КОС), готовят их микробные взвеси, проводят перекрестный посев взвесей двух культур микробов-ассоциантов на плотную питательную среду с яичным желтком, контрольные посевы этих же культур проводят штрихом, инкубируют, изучают характер изменения лецитовителлазной активности (ЛецА) у выделенных микробов-ассоциантов путем измерения ширины зоны помутнения в опыте и контроле, при увеличении ее в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более хотя бы у одной культуры диагностируют хронический тонзиллит.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что новый способ диагностики хронического тонзиллита позволяет повысить точность диагностики и сократить ее сроки.

Известен способ определения лецитовителлазной активности (ЛецА) у чистых культур микроорганизмов [3]. Данное свойство определяется для установления принадлежности микроорганизма к возбудителям заболеваний. Учитывается только наличие или отсутствие зоны помутнения среды вокруг культуры, измерение ширины этой зоны не проводится. В источниках патентной и научно-технической информации сведений о применении наличия лецитовителлазной активности или ее модификации в условиях межмикробных взаимодействий для постановки диагноза хронического тонзиллита не обнаружено.

Авторами экспериментально установлены межмикробные связи в микрофлоре миндалин здоровых и больных хроническим тонзиллитом. Выявлено, что в здоровом организме микробы-ассоцианты в 70% случаев не оказывают влияния друг на друга (индифферентны) в отношении факторов патогенности и персистенции, что, очевидно, способствует поддержанию стабильности биоценоза, а при болезни имеют место активные межмикробные связи, изменяющие выраженность факторов патогенности, в частности лецитовителлазной активности.

Предварительно была изучена микрофлора миндалин 37 здоровых и больных хроническим тонзиллитом.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, у больных хроническим тонзиллитом преобладают представители рода Staphylococcus (48,8%). Полученные авторами данные подтверждаются известными источниками литературы [4, 5]. Исходя из этого, для анализа межмикробных взаимодействий микрофлоры миндалин у больных хроническим тонзиллитом были выбраны микробы-ассоцианты: S.aureus (истинный патогенный микроорганизм) и коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) (условно-патогеные микробы).

Оценку модификации свойств микроорганизмов в ассоциации проводили методом "перекрестного посева". Для этого из суточных культур микробов-ассоциантов готовили 1 млрд. взвеси каждого микроорганизма в стерильном физиологическом растворе. На чашке Петри с плотной питательной средой, содержащей индикатор на выявление определенного свойства бактерии (кровь для выявления гемолитической активности, желток для выявления лецитовителлазной активности и т. д. ), с помощью стандартной микробиологической петли (диаметр 2 мм) производили посев штрихом (длина 15 мм, ширина 2 мм) одной культуры горизонтально, а вторую культуру высевали вертикальной полосой. Это контрольные посевы.

В центре чашки проводили посев этих же культур под прямым углом, где и происходило взаимодействие микроорганизмов (опыт). Чашки инкубировали в термостате при 37oС 24 часа, затем проводили учет результатов по уровню экспрессии активности исследуемого свойства (измеряли ширину зон действия фактора). Этот метод позволяет выявить качественные изменения свойств микроорганизмов в ассоциации (опыт) по сравнению с контрольными посевами.

Данным методом были оценены изменения следующих факторов патогенности и персистенции: гемолитической (ГА), лецитовителлазной (ЛецА) [3], лизоцимной (ЛА) и антилизоцимной (АЛА) активностей [6] (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, усиление ГА, ЛецА и ЛА наблюдалось у микроорганизмов, выделенных из микрофлоры слизистой миндалин как здоровых, так и больных хроническим тонзиллитом. Изменение АЛА имело место только у культур выделенных от больных (7,1% против 0).

Усиление ЛецА при взаимодействии культур микробов-ассоциантов, выделенных из микрофлоры слизистой миндалин больных, встречалось в 6 раз чаще, чем подобные изменения при взаимодействии культур, выделенных из микрофлоры миндалин здоровых людей. Анализируя полученные данные, пришли к выводу, что наиболее информативным свойством микроорганизмов для диагностики хронического тонзиллита является усиление ЛецА.

Способ осуществляется следующим образом.

Из микрофлоры слизистой миндалин выделяются чистые культуры S.aureus и КОС (S. warneri, S.hominis, S.haemolyticus и др.). Готовят взвеси суточных культур микробов-ассоциантов на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл и проводят посев взвесей двух культур микробов-ассоциантов: культура 1 - S.aureus и культура 2 - выделенная культура коагулазоотрицательного стафилококка (если выделено несколько культур КОС, то проводят посев каждой культуры с S.aureus).

Взвеси культур микробов-ассоциантов засевают на плотную питательную среду с яичным желтком в концентрации 20% желточной взвеси. Посев осуществляется стандартной микробиологической петлей (диаметр 2 мм) согласно чертежу.

Как видно из чертежа, посев производят штрихом (длина 15 мм, ширина 2 мм): культуру 1 (S.aureus) - горизонтально, культуру 2 (КОС - S.hominis) - вертикально. Это контрольные посевы. В центре чашки производится посев тех же культур для создания условий симбиоза путем пересечения штрихов под прямым углом (метод перекрестного посева). Посевы инкубируются при t=37oC в течение 24 часов. Производится измерение ширины зон помутнения в опыте и контроле.

В контроле ширина зоны помутнения измеряется в области центра штриха, а в опыте измеряется ширина зоны помутнения на расстоянии 2 мм от центра пересечения штрихов-посевов микробов-ассоциантов. Если в опыте, по сравнению с контролем, имеет место увеличение ширины зоны помутнения на 1 мм и более хотя бы у одной культуры, то это свидетельствует о повышении ЛецА штаммов в условиях симбиоза, что подтверждает диагноз хронического тонзиллита. Увеличение зоны помутнения менее чем на 1 мм является недостоверным (ошибка метода).

Пример 1. Ребенок Ч., 12 лет. При фарингоскопии миндалин гнойные пробки не обнаружены. Со слизистой миндалин выделены культуры 1 S.aureus и 2 S.hominis (КОС). Приготовлялись взвеси суточных культур исследуемых культур на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл. Взвеси микробов-ассоциантов засевались на плотную питательную среду с яичным желтком в концентрации 20% желточной взвеси. Посев осуществлялся стандартной микробиологической петлей (диаметр 2 мм) штрихом (длина 15 мм, ширина 2 мм): культура 1 (S.aureus) - горизонтально, культура 2 (КОС - S.hominis) - вертикально. Это были контрольные посевы. В центре чашки производился посев тех же культур для создания условий симбиоза методом перекрестного посева. Посевы инкубировались при t=37oC в течение 24 часов. Затем оценивалась модификация ЛецА в условиях симбиоза. ЛецА у S.aureus в контроле составила 6 мм, в опыте - 8,5 мм; ЛецА у S.hominis (КОС) в контроле равнялась 5 мм, в опыте - 7,2 мм (см. чертеж).

Таким образом, при перекрестном посеве S.aureus и S.hominis (КОС) происходило увеличение ширины зоны помутнения в опыте на 2,5 мм у первой культуры и на 2,2 мм у второй культуры по сравнению с контролем. Это позволило поставить диагноз хронического тонзиллита, который был подтвержден на основании анамнестических данных: имели место частые простудные заболевания - 3-4 раза в год, жалобы ребенка на слабость, быструю утомляемость, периодические боли в области коленных суставов. Клинический диагноз: "Хронический тонзиллит в стадии субкомпенсации". Было проведено лечение, за год наблюдения отмечалось улучшение самочувствия, боли в коленных суставах не беспокоили.

Пример 2. Ребенок К., 13 лет. При фарингоскопии миндалин гнойные пробки не обнаружены. Со слизистой миндалин выделены культуры 1 S.aureus, 2 S.epidermidis (КОС), 3 S.warneri (КОС). Исследования проводились методом перекрестного посева. Изучались модификации ЛецА в паре S.aureus - S.epidermidis (пара 1) и в паре S.aureus - S.warneri (пара 2). ЛецА у S.aureus в паре 1 в контроле составила 5 мм, в опыте - 7 мм; ЛецА у S. epidermidis (КОС) в контроле равнялась 5 мм, в опыте - 8 мм. В паре 2 ЛецА S.aureus в контроле составила 5 мм, в опыте - 5,9 мм; а ЛецА S.warneri в контроле равнялась 5 мм, в опыте - 5 мм, т.е. не изменилась. Таким образом, при перекрестном посеве S. aureus и S.epidermidis (КОС) происходило увеличение ширины зоны помутнения в опыте на 2 мм у первой культуры и на 3 мм у второй культуры по сравнению с контролем. При взаимодействии S.aureus и S.warneri (КОС) наблюдалось увеличение ширины зоны помутнения менее чем на 1 мм, что является недостоверным. Но увеличение ширины зоны помутнения в первой паре на 1 мм и более позволило поставить диагноз хронического тонзиллита, который был подтвержден на основании анамнестических данных: имели место частые простудные заболевания - 3-4 раза в год, жалобы ребенка на слабость. Клинический диагноз: "Хронический тонзиллит в стадии субкомпенсации". Было проведено лечение, за год наблюдения отмечалось улучшение самочувствия.

Пример 3. Ребенок Б. , 12 лет. При фарингоскопии миндалин обнаружены гнойные пробки. Со слизистой миндалин выделены культура 1 S.aureus и культура 2 S. mucilaginos (КОС). При оценке модификации ЛецА в условиях симбиоза усиления ее не обнаружено, на основании чего диагноз хронического тонзиллита не подтвержден. Анамнестические данные показали отсутствие ангин в анамнезе. В данном случае ребенку был поставлен диагноз: "Ангина", и проведена консервативная терапия с положительным эффектом.

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить эффективность диагностики, а именно повысить точность и сократить ее сроки. Так, например, безангинные формы хронического тонзиллита позволяют вовремя поставить верный диагноз, начать адекватное лечение и предотвратить возможные осложнения.

Источники информации

1. Тетерин Ф.Н., Щевичкин Г.А., Горбунов В.А., Кодица Н.И. К диагностике безангинных форм хронического тонзиллита. // Военно-медицинский журнал - 1983, - 9, - с.54-55.

2. Пальчун В.Т. Ангина, хронический тонзиллит и сопряженные с ними заболевания (современная оценка проблемы). // Терапевтический архив - 1988, - т.60, - 10, - с. 56-60.

3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Биргер М.О.,- М., 1982, - с.157, 252-253.

4. Белобородова Н.В., Вострикова Т.Ю. Особенности микрофлоры зева у детей в отделениях интенсивной терапии.// Антибиотики и химиотерапия - 1998, - т.43, - 8, - с.16-22.

5. Преображенский Б.С., Попова Г.Н. Ангина, хронический тонзиллит и сопряженные с ним заболевания. М., "Медицина", 1970.

6. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. // ЖМЭИ - 1984, - 2, - с. 27-28. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ диагностики хронического тонзиллита, отличающийся тем, что из микрофлоры слизистой миндалин выделяют чистые культуры S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков, готовят их микробные взвеси, проводят перекрестный посев взвесей двух культур микробов-ассоциантов на плотную питательную среду с яичным желтком, контрольные посевы этих же культур проводят штрихом, инкубируют и изучают характер изменения лецитовителлазной активности (ЛецА) у выделенных микробов-ассоциантов путем измерения ширины зоны помутнения в опыте и контроле, при увеличения ее в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более хотя бы у одной культуры диагностируют хронический тонзиллит.