ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2161042

ОБНАРУЖЕНИЕ И ЛЕЧЕНИЕ РАКА 

Имя заявителя:  Рикардо Дж. Моро (CA) 
Имя изобретателя:  Рикардо Дж. Моро (CA) 
Имя патентообладателя: Рикардо Дж. Моро (CA) 
Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Большая Спасская 25, стр.3, ООО "Городисский и Партнеры", Лебедевой Н.Г.
Дата начала действия патента:  1995.09.18 

Изобретение относится к области медицины, а именно к обнаружению и лечению рака. Способ включает стадию введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-протеина в биологической пробе. Следующей стадией служит определение связывающих сторон рецептора альфа-протеина в биологическом материале, которые вступили в реакцию с мечеными антителами или альфа-протеином, для обнаружения рака. Предпочтительно, до стадии введения выполнить стадию исследования биологической пробы пациента. Способ включает стадию введения антитела к рецептору альфа-фетопротеина в пораженные раком клетки пациента. Затем следует стадия реакции антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина зараженных раком клеток для угнетения роста зараженных раком клеток или омертвения зараженных раком клеток. Изобретение включает также способ наблюдения за пациентом, способ лечения пациента от рака. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее установленные сроки после лечения на уровни размеров рецептора альфа-фетопротеина. Техническим результатом изобретения является создание высокоспецифичного метода диагностики и лечения рака.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к обнаружению и/или лечению рака. А именно, по настоящему изобретению используется наличие рецептора альфа-фетопротеина в качестве основы для обнаружения рака, сдерживания распространения или избавления от рака. 

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Двадцать лет назад Абелев и соавторы представили отчет о существовании первого карциноэмбрионального антигена - альфа-фетопротеина (АФП) [Абелев Г. И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова 3.А. и Ирлин И.С., Трансплантация 1, 174, (1963)]. Хотя данный протеин является основным циркулирующим протеином во время эмбрионального периода, он практически исчезает после рождения, нормальная концентрация в сыворотке взрослого человека - ниже 50 мг/мл [Ruoslahti, Е. and Seppals, М. Int. J. Cancer 8, 374 (1971)]. Однако в случае некоторых злокачественных заболеваний, таких как печеночно-клеточный рак или эмбриональный рак, уровень плазмы может быть в тысячу раз выше [Ruoslahti, Е. and Seppals, М. Adv. Cancer Res., 29, 275 (1979)]. Данное открытие привлекло внимание не только практикующих врачей, которые предусмотрели новый способ обнаружения злокачественности и контроля за страдающими от рака пациентами, но и интерес исследователей, изучающих физиологию данного протеина во время эмбрионального периода. 

Одним из первых изучаемых параметров было распределение альфа-протеина в эмбрионе. Используя способ иммунопериокисления, Бенно и Уильяме описали распределение альфа-фетопротеина в развивающемся мозгу крысы [Benno, R.H. and Williams, T. H. , Brain Res. 142, 1982 (1978)]. Некоторое время спустя ряд исследований указал на локализацию протеинов плазмы в пределах развивающихся нервных клеток различных видов, включая птиц и людей [Trojan, J. and Uriel, J. , J. Oncodevelop. Biol. Med. 1, 107, (1980); Uriel, J., Trojan, J., Dubouch, P. and Pieiro, A., Path. Biol. 30, 79 (1982); Moro, R. and Uriel, J., J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Dziegielewska, K.M., Evans, C.A.N. , Lorscheider, E.L., Malinowska, D.H., Mollgard, K., Reynolds, M.L., and Saunders, N.R., J. Physiol. 318, 239 (1981); Mollgard, К., Jacobsen, M., Krag-Jacobsen, G., Praetorius-Claussen, P. and Saunders, N.R., Neurosci. Lett. 14, 85 (1979)]. Для определенной ткани или органа динамика окраски альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина следует довольно постоянному паттерну у различных видов [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. and Pieiro, A., Ann. N.Y. Acad. Sci. 417, 321 (1983)]. Когда нервная структура недоразвита, внутриклеточный альфа-фетопротеин или сывороточный альбумин не обнаруживаются. Затем внезапно и на некоторое время, в зависимости от вида, оба протеина наблюдаются одновременно даже в пределах одной клетки [Torand-Allerand, C.D. Nature 286, 733 (1980)]. Затем интенсивность окраски постепенно снижается и количество положительных клеток уменьшается, сначала для альфа-фетопротеина, затем для сывороточного альбумина. Развитые структуры являются отрицательными для обоих протеинов. Другие составные элементы сыворотки, такие как иммуноглобулин или овальбумин куриного зародыша никогда не обнаруживаются в нервных клетках во время эмбрионального периода, несмотря на их присутствие в цереброспинальной жидкости [Fielitz, W., Esteves, A. And Moro, R., Dev. Brain Res. 13, 111 (1984)]. 

Поглощение альфа-фетопротеина эмбриональными клетками. 

Одним вопросом, возникшим в результате данных начальных наблюдений, является вопрос о том, что происходит ли поглощение альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина от внеклеточных источников или они синтезированы in situ. В то время как все еще неясно, способны ли нервные клетки к синтезу протеинов плазмы [Ali, М. , Raul, Н. and Sahib, М. Dev. Brain Res. 1, 618 (1981); Ali, М., Mujoo, К. and Sahib, М. Dev. Brain Res. 6, 47 (1983); Schachter, B.S. and Toran-Allerand, C.D., Dev. Brain Res. 5, 95, (1982); Pieiro, A. , Calvo, M., Iguaz, F., Lampreave, F. and Naval, J. Int. J. Biochem. 14, 817 (1982)], было показано как in vitro [Uriel, J., Faivre-Bauman, A., Trojan, J. , and Foiret, D. Neurosci. Lett. 27, 171 (1981); Hajeri-Germond, M., Trojan, Uriel, J. and Hauw, J.J. Dev. Neurosci. 6, 111 (1984)], так и in vivo [Villacampa, M. J. , Lampreave, F., Calvo, M., Pieiro, A. and Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J. , Int. Dev. Neurosci 2, 143 (1984)], что нейробласт может легко поглощать альфа-протеин и сывороточный альбумин из внеклеточных источников. Были проведены эксперименты in vivo с гомологичным и гетерологичным протеинами. В первом случае [Villacampa, M.J., Lampreave, F., Caivo, M., Pieiro, A. and Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984)] было показано, что при введении беременным крысам 125I-альфа-фетопротеин локализируется в мозгу зародыша, а также в других органах зародыша, таких как кишка, кожа и язык, органах, в которых до этого был обнаружен природный внутриклеточный альфа-фетопротеин [Trojan, J. and Uriel, J., J. Oncodev. Biol. Med. 3, 13 (1982)]. Вторая серия экспериментов [Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci 2, 143 (1984)] показала, что, когда сыворотка новорожденной крысы была введена в полость среднего мозга куриного зародыша, альфа-фетопротеин и сывороточный альбумин крысы могли быть обнаружены в тех же самых местах, как и их природные эквиваленты. Это также указывает на то, что альфа-фетопротеин и сыворотный альбумин одного вида принимаются клетками других видов, таким образом указывая на структуры и механизмы, сохранившиеся в процессе эволюции. Это в свою очередь, предполагает включение основного биологического начала. 

Несмотря на высокую концентрацию вводимого иммуноглобулина крыс, окраска данного протеина была отрицательной. Это не является результатом высокого молекулярного веса (150000), который мог бы препятствовать пассивной диффузии, поскольку овальбумин (молекулярный вес = 43000) не мог быть обнаружен даже в том случае, когда он был введен в концентрации, в два раза превышающей нормальную молярную концентрацию альфа-фетопротеина в эмбрионной цереброспинальной жидкости [Fielitz, W. , Esteves, A. and Moro, R., Dev. Brain Res. 13, 111 (1984)]. Эта селективность говорит в пользу гипотезы об специфичном рецепторно опосредованном механизме эндоцитоза [Moro, R. and Uriel, J. , J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci. 2, 143 (1984)]. 

Поглощение альфа-фетопротеина зависит от дифференциации клеток. 

Однако в настоящее время все еще не ясно, является ли поглощение альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина явлением, зависящим от клеток, или когда окраска исчезает, результатом низкой способности внеклеточного протеина ввиду закрытия гематоэнцефалического барьера или низкой концентрации циркулирующего альфа-фетопротеина в конце эмбрионального периода. Было показано сначала на куриных зародышах [Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253 (1983)] , затем и на человеческом зародыше [Jacobsen, М., Lassen, I.C. and Mollgard, К., Tumor Biol. 5, 55 (1984)], что позвоночные ганглиозные нервные клетки проходят полный отрицательно-положительный-отрицательный цикл окрашивания для альфа-фетопротеина до того, как сыворотка достигает наивысшего пика. Более того, когда альфа-фетопротеин становится необнаруживаемым, сыворотный альбумин присутствует на протяжении некоторого времени, таким образом указывая, что данные сывороточные протеины достигают ганглиозных нейробластов. 

Рецепторы альфа-фетопротеина в недоразвитых клетках. 

Принятие клетками альфа-фетопротеина предполагает существование специфичного рецептора, экспрессия которого регулируется в зависимости от степени дифференциации клетки [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. and Pieiro, A., Ann. N. Y. Acad. Sci. 417, 321 (1983); Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253 (1983)]. Предыдущий отчет [Uriel, J., Bouillon, D., Russel, C. and Dupiers, M., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S.A. 73, 1452 (1976)] показал присутствие двух ультрацентрифугированных фракций, содержащих альфа-фетопротеин в недоразвитой цитозоли крысы: 4-ой фракции, полностью соответствующей альфа-фетопротеину и 8-ой фракции, в которой иммунологическое обнаружение альфа-фетопротеина было возможно только после обработки с 0,4 моль KCl. Эта обработка преобразовывала 8-ую фракцию в 4-ую. Весьма вероятно, что 8-ая фракция соответствовала комплексу рецептор-альфа-фетопротеин, который был диссоциирован при высоких концентрациях KCl, хотя в то время еще не появилось понятие о рецепторе альфа-фетопротеина. Эту диссоциацию комплекса рецептор-альфа-фетопротеин с KCl также наблюдали Smalley and Sarcione [Smalley, J.R. and Sarcione, E.J. Bioch. Biophys. Res. Comm. 94, 1429, (1980)], которые также представили доказательство того, что молекула альфа-фетопротеина могла бы быть синтезирована недоразвитыми клетками матки крысы. 

Экспрессия рецептора альфа-фетопротеина в зараженных раком клетках. 

Поскольку раковые клетки имеют ряд общих биохимических и антигенных признаков с эмбриональными клетками [Uriel, J., Adv. Cancer. Res. 29, 127, (1979)] , возможно, что клетки злокачественного новообразования, полученные от тканей, поглощающих альфа-фетопротеин во время эмбрионального периода, могут повторно экспрессировать соответствующий рецептор и таким образом еще раз принять альфа-фетопротеин. В поддержку данной гипотезы Sarcione et al. [Sarcione, E.J., Zioty, M., Delluorno, D.S., Mizejewski, G and Jacobson, H., Cancer Res. 43, 3739 (1983)] обнаружили альфа-фетопротеин в 8-ом комплексе, полученном из раковой опухоли молочной железы человека, который мог бы быть диссоциирован при обработке KCl таким же образом, как и в опытах, использующих недоразвитые цитозоли крыс. Недавно данные авторы продемонстрировали, что альфа-фетопротеин синтезируется линией клеток рака молочной железы человека MCF-7 в качестве комплекса, который необходимо подвергнуть диссоциации для возможности иммунологического обнаружения альфа-фетопротеина [Sarcione, E.J. and Hart, D., Int. J. Cancer 35, 315 (1985)]. С другой стороны, эта клеточная линия [Uriel, J., Failly-Crepin, C., Villacampa, M.J., Pieiro, A., and Gueskens, M., Tumor Biol. 5, 41 (1984)] и инфицированная никелем рабдомисаркома крысы [Uriel, J., Puopon, M.F. and Geuskens, M., Br. J. Cancer 48, 263 (1983)] показывает захват альфа-фетопротеина in vitro. В качестве подтверждения этих непрямых результатов поверхностные рецепторы для альфа-фетопротеина были обнаружены у линии MCF-7 [Villacampa, M.J., Moro, R. , Naval, J., Failly-Crepin, Ch., Lampreave, F. and Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122, 1322 (1984)]. Связующие параметры указывают на двухсайтовую рецепторную модель, обладающую положительной кооперацией. Участок высокого сродства имеет Kd 1,5 х 10-9 M с n-2000/клетку. Участок низкого сродства, представленный при 320000/клетку, имеет Kd 2,2 х 10-7 M. Более поздние исследования показали наличие подобной рецепторной системы на поверхности лимфатических клеток YACT мыши, которая отсутствует у T-клеток нормальной взрослой мыши [Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301 (1985)]. 

Эти исследования были проведены параллельно с экспериментами in vivo, при которых в опухоли молочной железы спонтанно рожающей мыши вводят радиойодированный альфа-фетопротеин. Тканевое распределение радиоактивности показало соотношение опухолевой/нормальной ткани (печени) как 3,6 [Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, Ch. C.R. Acad. Sci. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984)]. Ауторадиография опухолевых участков данных животных показала значительное накопление серебряных зернышек вокруг мембраны ядра злокачественных клеток, но не здоровых клеток [Uriel, J. , Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984)]. 

Сцинтриграфическая визуализация опухолей мыши с использованием 131I-альфа-фетопротеина

Используя 131I-альфа-фетопротеин, были получены положительные сцинтриграфические изображения опухолей молочной железы мыши размером 3-4 мм [Uriel, J. , Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moro, R., Heuguerot, C., Vercelli-Retta, J., Fielitz, W. , Lpez, J. J. and Roca, R. Nuclear Med. Comm. 5, 5 (1984)]. В действительности, одиннадцать из двенадцати случаев подобной опухоли были обнаружены с помощью стандратной гамма-камеры, подсоединенной к компьютеру. Другая опухоль мыши, нейробластома, могла быть также сканирована подобным образом [Hajeri-Germond, М. , Naval, J., Trojan, J. and Uriel, J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)]. 

Экспрессия захвата альфа-фетопротеина или прямое доказательство рецептора альфа-фетопротеина было показано на нескольких различных типах опухолей, таких как: рабдомиосаркома крысы [Uriel, J., Puopon, M.F. and Geuskens, М. , Br. J. Cancer 48, 263 (1983)], нейробластома мыши [Hajeri-Germond, М., Naval, J., Trojan, J. and Uriel, J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)], рак молочной железы мыши и человека [Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J., Failly-Crepin, Ch. , Lampreave, F. and Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122, 1322 (1984); Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301, (1985); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R. , Naval, J., and Failly-Crepin, Ch., C.R. Acad. Sci. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, Ch., Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moro, R., Heuguerot, C., Vercelli-Retta, J. , Fielitz, W., Lpez, J.J. and Roca, R., Nuclear Med. Comm. 5, 5 (1984); Biddle, W. and Sarcione, E.J. Breast Cancer Res. Treat. 10, 281 (1987)] , T-лимфомы мыши [Naval, J. , Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301 (1985)], лимфомас T-клеток и C-клеток человека [Laborda, J., Naval, J., Aliouche, M., Calvo, M., Georgoulias, V. , Mishal, Z. and Uriel, J. Int. J. Cancer 40, 314 (1987)]; Calvo, M., Laborda, J., Naval, J., Georgoulias, V. and Uriel, J., представлено на XIII заседании ISOBM (Париж 1985); Torres, J.M., Anel. A. and Uriel, J. , J. Cell Physiol. 150, 458 (1992); Torres, J.M., Gueskens, M. and Uriel, J. Int. J. Cancer 47, 112 (1991)], а также фитогемагглютинин, возбужденный T-лимфоцитами человека [Torres, J.M., Laborda, J., Naval, J., Darracq, N., Calvo, M. , Mishai, Z. and Uriel, J. Mol. Immunology 26, 851 (1989)], линия моноцитных клеток злокачественного новообразования U937 [Suzuki, Y., Zeng, C. Q. , Alpert, E. J. Clinic. Invest. 90, 1530 (1992)] и линия клеток рака толстой кишки человека НТ29 [Esteban, С., Gueskens, M. and Uriel, J., Int. J. Cancer 49, 425 (1991)]. 

Данные открытия указывают на положение рецептора альфа-фетопротеина как широко распространенного карциноэмбрионального антигена, относящегося к наличию злокачественной опухоли, а не к типу новообразования. 

Моноклональные антитела против рецептора альфа-фетопротеина. 

Меченый альфа-фетопротеин (FITC, радиоактивный индикатор) не связывается с опухолевыми клетками на срезах парафиновой ткани вероятно ввиду частичной денатурации связывающих рецепторы сайтов в процессе фиксации и ввиду сравнительно низкого сродства, которое он проявляет по отношению к рецептору. Таким образом моноклональные антитела в отношении рецептора альфа-фетопротеина были продуцированы с помощью пула рака молочной железы человека в качестве иммуногена [Moro, R., Tamaoki, T., Wegmann, T.G., Longenecker, В.М. and Laderoute, М.Р. Tumor Biol. 14, 116 1993), включенная с ссылкой]. 

Два иммуногена, производящие моноклональные антитела, распознают 67 KD двойной связки на геле PAGE в невосcтанавливающих условиях. 67 KD связки также реагируют с 125I-альфа-фетопротеином. Данные моноклональные антитела вступают в реакцию со связующим сайтом рецептора альфа-фетопротеина, поскольку они ингибируют связывание альфа-фетопротеина с опухолевыми клетками, и наоборот, они ингибируют связывание с клетками в присутствии большого избытка альфа-фетопротеина. Моноклональные антитела не взаимодействуют с альфа-фетопротеином. Они распознают эмбриональные клетки и раки молочной железы на срезах ткани, но не аденомы молочной железы или большинство других здоровых развитых тканей. 

На протяжении последних десятилетий ученые пытались охарактеризовать антигены, связанные со злокачественными образованиями. Рецептор альфа-фетопротеина, который должен рассматриваться как карциноэмбриональный антиген, мог бы соответствовать многим требованиям, предъявляемым к клинически используемому маркеру опухоли. 

Дальнейшая работа с использованием моноклональных антител против данного широко распространенного антигена, относящегося к раку, позволит установить их клиническую полезность, а также изучить физиологическую роль рецептора альфа-фетопротеина. 

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способу обнаружения рака у пациента. Способ включает стадии введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Затем следует стадия определения связующих участков рецептора альфа-фетопротеина в биологическом материале, которые вступают в реакцию с мечеными антителами или меченым альфа-фетопротеином для определения наличия рака. Желательно до стадии введения взять биологическую пробу из организма пациента. 

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток у пациента. Данный способ включает стадии введения антител рецептора альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Затем следует стадия реакции антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток. 

Настоящее изобретение относится к способу наблюдения за пациентом. Способ включает стадии лечения рака у пациента. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее установленные сроки после лечения уровней клеточного рецептора альфа-фетопротеина. 

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента. Данный способ включает стадии проведения тестов у пациента на рецептор альфа-фетопротеина. Затем следует стадия введения антител рецептора альфа-фетопротеина или альфа-фетопротеина в организм пациента для реакции с раковыми клетками пациента в случае, если тесты указывают на наличие рецепторов альфа-фетопротеина у пациента. 

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток пациента. Данный способ включает стадии введения модифицированного альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Затем следует стадия взаимодействия модифицированного альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток. 

Целью изобретения является диагностика и последующий контроль за раковыми заболеваниями и беременностью путем обнаружения рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма и тканях. Хотя принципы и способы обнаружения рецептора альфа-фетопротеина в растворе (общая вода организма) или твердой основе (срезы ткани) похожи, они будут описаны отдельно для наведения ясности. 

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Предпочтительное осуществление изобретения и предпочитаемые способы применения изобретения приводятся в прилагаемых чертежах:

Фиг. 1 - диаграмма раковых и доброкачественных опухолей. 

Фиг. 2 - фотография рака молочной железы, где светлые клетки - раковые. 

Фиг. 3 - фотография рака молочной железы, где темно-коричневые клетки - раковые. 

Фиг. 4 - доброкачественная аденома молочной железы. 

Фиг. 5 - фотография рака легкого, где коричневые клетки являются раковыми клетками. 

Фиг. 6 - фотография рака желудка, где темно-коричневые клетки - раковые. 

Фиг. 7 - фотография рака кишки. 

Фиг. 8 - диаграмма, демонстрирующая угнетение роста Р-388 рецептором альфа-фетопротеина-1. 

Фиг. 9 - фотография трех животных под наблюдением наверху и четырех животных, подвергнутых лечению, через пять дней после инъекции. 

Фиг. 10 - фотография животных другого опыта, в котором три животных здоровы, и два страдают от крупных опухолей. 

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака у пациента. Способ включает стадии введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Биологической пробой может быть кровь, слюна, ткань, сыворотка, слизь, мокрота, моча, слезы или материал, содержащий раковые клетки. Биологической пробой может быть срез ткани. Срезом ткани может быть либо неподвижная ткань, свежая ткань или замороженная ткань. Антителами могут быть моноклональные антитела или поликлональные антитела. Затем следует стадия определения связующих участков рецептора альфа-фетопротеина в биологическом материале, которые вступили в реакцию с мечеными антителами или меченым альфа-фетопротеином для определения наличия рака. Желательно до стадии введения провести стадию получения биологической пробы из организма пациента. 

Стадия введения может включить стадию введения антител, меченных радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченного радиоизотопом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина в биологической пробе. Определяющая стадия включает стадию определения наличия радиоактивности в биологической пробе или может включать стадии покрытия биологической пробы фотографической эмульсией, проявления фотографической эмульсии и наблюдения за биологической пробой с покрытием. Альтернативно биологической пробой является пациент, и стадия введения включает введение в организм пациента антител, меченных радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченного радиоизотопом. 

При альтернативном осуществлении стадия введения включает стадию введения антител, меченных ферментом, или альфа-фетопротеина, меченного ферментом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Антитело, меченное ферментом, или альфа-фетопротеин, меченый ферментом, изменяют цвет биологической пробы с известным цветом для определения наличия рака. Фермент может переокислиться, и стадия введения может включить стадия введения антитела, меченного перекисным соединением, в ткань пациента. Альтернативно стадия введения может включить стадии помещения капли биологической пробы на участок на нитроцеллюлозу или нейлон и добавления антитела, меченного перекисным соединением, к участку. Определяющая стадия включает стадию определения, поменял ли цвет участок на нитроцеллюлозе или нейлоне. 

При другом осуществлении изобретения антитело, меченное ферментом, или альфа-фетопротеин, меченный ферментом, выделяет ионы, которые изменяют электрическую проводимость раствора, в котором помещена биологическая проба. Определяющая стадия включает стадию измерения электрической проводимости раствора для определения наличия рака в биологической пробе. 

При другом осуществлении изобретения стадия введения может включать стадию введения антител, меченных флюорохромом, или альфа-фетопротеин, меченный флюорохромом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина в биологической пробе. Определяющая ступень включает стадии облучения биологической пробы ультрафиолетовым излучением и измерения излучения фотона из облученной биологической пробы. В качестве другого примера биологической пробой может быть мазок биологического материала, содержащего раковые клетки на предметном стекле, и определяющая стадия включает стадию обследования мазка с помощью микроскопа или флюроцитометрией. 

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток пациента. Способ включает стадии введения антител рецептора альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Антителами могут быть моноклональные антитела, поликлональные антитела, антитела других видов, помимо организма пациента, или антитела, произведенные в искусственной среде от лимфоцитов такого же вида, как и в организме пациента. Затем следует стадия взаимодействия антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-протеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток. 

Стадия введения может включать стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина в организм пациента. Стадия введения включает стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина внутривенно в кровяное русло пациента. Альтернативно стадия введения может включать стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина пациенту в участок, проксимальный раковым клеткам. 

Альтернативно стадия введения может включать стадию вакцинации пациента против раковых клеток. Стадия вакцинации может включать стадию введения рецептора альфа-фетопротеина вида, помимо пациента, пациенту с тем, чтобы вызвать производство антител рецептора альфа-фетопротеина пациентом против введенного рецептора альфа-фетопротеина. Антитела рецептора альфа-фетопротеина, произведенные пациентом, вступят в перекрестную реакцию с рецептором альфа-фетопротеина или раковыми клетками пациента. 

Стадия реакции может включать стадию реакции рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с антителами рецептора альфа-фетопротеина с тем, чтобы рецептор альфа-фетопротеина раковых клеток был блокирован или его функциональность была нарушена. Альтернативно антитела рецептора альфа-фетопротеина являются антителами рецептора альфа-фетопротеина, которые фиксируются на комплементе. Затем стадия реакции включает стадию реакции антител рецептора альфа-фетопротеина, которые фиксируются на комплементе, с раковыми клетками с тем, чтобы во время возникновения реакции цепи комплемента, отверстия проколаны в мембране раковых клеток, которые убивают раковые клетки. 

Альтернативно, антитела рецептора альфа-фетопротеина соединяются с лекарственными препаратами или токсинами. Затем стадия реакции включает стадию реакции антител рецептора альфа-фетопротеина, соединенного с лекарственными средствами или токсинами, с раковыми клетками с тем, чтобы раковые клетки поглотили лекарственные средства или токсины, где ферменты раковых клеток отрезают лекарственные средства или токсины от антител, наносимых непоправимый ущерб или вызывающих омертвение клеток. 

При другом альтернативном осуществлении антитела рецептора альфа-фетопротеина мечены радиоактивным изотопом. Затем стадия реакции включает стадию реакции меченных радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина с раковыми клетками пациента с тем, чтобы радиация от меченных радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина в близости от ДНК раковой клетки наносила повреждение ДНК, таким образом вызывая омертвение раковых клеток. 

Настоящее изобретение относится к способу наблюдения за пациентом. Данный способ включает стадии лечения рака у пациента. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее определенные сроки после лечения уровней рецептора альфа-фетопротеина. 

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента. Данный способ включает стадии обследования пациента на рецептор альфа-фетопротеина. Затем следует стадия введения антител рецептора альфа-фетопротеина или альфа-фетопротеина в организм пациента для проведения реакции с раковыми клетками пациента в случае, если обследование указывает на наличие рецептора альфа-фетопротеина у пациента. 

Настоящее изобретение относится к лечению раковых клеток пациента. Данный способ включает стадии введения модифицированного альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Модифицированный альфа-фетопротеин получен либо синтетически, либо он является частью альфа-фетопротеина. Затем следует стадия реакции модифицированного альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвления раковых клеток. 

Стадия введения может включать вливание модифицированного альфа-фетопротеина в организм пациента. Вливание может быть вливанием модифицированного альфа-фетопротеина внутривенно в кровяное русло пациента. Альтернативно вливание является вливанием модифицированного альфа-фетопротеина в организм пациента в участок, проксимальный раковым клеткам. 

Стадия реакции может включать взаимодействие рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с модифицированным альфа-фетопротеином таким образом, чтобы участки рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток были блокированы или их функциональность была повреждена. 

В общем, за исключением применения или использования альфа-фетопротеина, модифицированный альфа-фетопротеин или антитела, вступающие в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина, вышеописанные приемы являются известными специалисту в данной области. 

Способы изобретения

В жидкостях организма. 

Либо путем секреции, либо пассивной диффузии после омертвения клетки рецептор альфа-фетопротеина от раковых или эмбриональных тканей может быть введен в кровяное русло и затем во многие другие жидкости организма, такие как моча, слезы, слюна и т.д. Концентрация рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма (включая сыворотку) будет значительно отличаться у здоровых пациентов и беременных или зараженных раком пациентов. Данный факт может использоваться в целях диагностики. Также изменение концентрации рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма может быть использовано в процессе последующих наблюдений за пациентом. Например, у пациента был установлен диагноз аденокарцинома молочной железы, и сывороточная концентрация рецептора альфа-фетопротеина высокая. В результате проведенной операции опухоль была удалена. Последующие исследования рецептора альфа-фетопротеина показывают значительное уменьшение немедленно после операции, затем процесс останавливается. Тем не менее через шесть месяцев концентрация рецептора альфа-фетопротеина в сыворотке начинает увеличиваться, что указывает на рецидив или метастаз рака, что будет предшествовать традициональным клиническим или другим диагностическим способам. Предупрежденный этим недорогим тестом, предложенным выше, врач теперь будет искать злокачественную массу с помощью более сложных, дорогостоящих и, если необходимо, инвазивных способов. 

В пробах тканей. 

Рецептор альфа-фетопротеина присутствует в большинстве раковых клеток. Таким образом, он может быть обнаружен иммунотканевым средством или инкубацией с альфа-фетопротеином, меченным надлежащим образом (хотя он не был успешно использован на парафиновых срезах, он хорошо работает на замороженных срезах). Исходя из вышесказанного может быть произведена диагностика злокачественности. Помимо этого, используя флюоресценцию в качестве метки, только несколько положительных клеток могут быть обнаружены на срезе ткани, что сокращает возможность ошибки, совершаемой при использовании классического патологического анализа, при котором несколько раковых клеток в пределах нормальной согласно другим параметрам ткани могут быть не обнаружены. Также, поскольку экспрессия альфа-фетопротеина зависит не от анатомических изменений, а от дифференциации и биохимических изменений, существует вероятность того, что клетки, которые выглядели бы нормальными, но на самом деле находятся на ранней стадии онкогенеза, будут положительными в результате теста обнаружения рецептора альфа-фетопротеина. 

Для более полного понимания, хотя и не существует принципиальной разницы и используются только незначительные различия в технологии, обнаружение рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма и на срезах ткани описано далее отдельно. 

Жидкости организма. 

Пример 1. 

По этому примеру 22 пробы сыворотки не зараженных раком пациентов и 17 проб зараженных раком пациентов были испытаны иммуноферментным анализом на концентрацию рецептора альфа-фетопротеина. Была использована следующая технология: на 96-луночный планшет иммуноферментного анализа были нанесены на 1 час или на всю ночь пробы сыворотки вышеописанных групп, разведенных 1/16384 в фосфатно-солевом буферном растворе (0,05 М РO4, 0,15 М NaCl, pH 7,5). На некоторые лунки были нанесены подобным образом плевральный выпот пациента, страдающего от метастаз в легком при раке молочной железы, разбавленные 1/256. Данный материал, код названия которого Р89, был использован в качестве стандарта по причине его большого количества, что позволило использование Р89 в качестве стандарта для сравнения всех проб против остальных во всех опытах. После 3 обработок фосфатно-солевым буфером неспецифичные связующие участки были блокированы 1% овальбумином или желатином в фосфатно-солевом буферном растворе на 1 час. После 3 обработок 100 мкл раствора 1/200 в 1% овальбумине в фосфатно-солевом буфере асцитов моноклональных антител, полученных в мышах и направленных против рецептора альфа-фетопротеина (моноклональное антитело 167Нx4, как описано в [Moro, R., Tamaoki, Т., Wegmann, T.G., Longenecker, В.М., М.Р. Tumour Biol. 14, 116 (1993)], включенная со ссылкой), был инкубирован в каждой лунке на протяжении 3 часов. Затем лунки были обработаны 3 раза фосфатно-солевым буфером и коммерческий конъюгат перекисного соединения иммуноглобулина был добавлен в концентрации, рекомендованной поставщиком (Sigma Chemicals, С. Льюис). Через час лунки были обработаны 3 раза фосфатно-солевым буфером, и цветовой субстрат для перекисного соединения был добавлен в концентрации, рекомендованной поставщиком (Sigma). Все инкубации были произведены при комнатной температуре. Через 30 минут оптическая плотность в каждой лунке достигла 405 нм, был использован стандартный счетчик Titertek. Результаты отражены на фиг.1 и далее по тексту:

ОРГАН - ТИП ОПУХОЛИ

1 Яичник - Аденокарцинома

2 - Лейкоз, лимфоидный

3 Конечность - Саркома

4 Матка - Аденокарцинома

5 Мягкая ткань - Саркома

6 Яичник - Аденокарцинома, кистозная

7 Прямая кишка - Аденокарцинома

8 Таз - Карциноматоз

9 - Распространенная опухоль

10 Мозг - Астроцитома

11 Легкое - Неоплазия

12 Печень - Первичная гепатома

13 Таз - Неоплазия

14 Почка - Неоплазия (метастатическая)

15 Ободочная кишка - Неоплазия

16 Кость - Остеосаркома

В таблице (см. в конце описания) указан пациент, тип опухоли и соотношение между пробой и Р89, используемого в качестве стандарта на протяжении всего изучения. Результаты указывают на то, что у всех, кроме одного, страдающих от раковых заболеваний пациентов результаты были положительными, когда порог между положительным и отрицательным был установлен на 54% Р89. Результаты не зараженных раком пациентов были все отрицательными, кроме одного, с использованием такого же порога. Независимый T-тест показал следующие результаты (используя анализ данных в Excel (ТМ)). 

Т-тест: Две пробы с неравными изменениями. 

Переменная 1 - Переменная 2

Средняя 84,74571 - 33,26582

Изменения 709,9173 - 300,2051

Наблюдения 16 - 22

Корреляция Пирсона N - нет

Группированная варианса - 3,5

Коэффициент очистки - 24,02215

Транслокация - 6,758736

P(T т) однохвостовый - 2,72Е-07

т Критический однохвостовый - 1,710882

P(T т) двухвостовый - 5,44Е-07

т Критический двухвостовый - 2,063898

Двухвостовый анализ - p= 0,00000054, значительная цифра даже для небольшого количества рассматриваемых проб. 

Пациент (не указанный в таблице), который относился к отрицательной группе контроля, был положительным. Принимая во внимание полученные данные, лечащий врач провел сканирование пациента компьютерной аксиальной томографией и обнаружил опухоль, которая оказалась злокачественной гипернефромой. Данная злокачественность была обнаружена первоначально с использованием данного теста и ЗАТЕМ была подтверждена клинически. 

Фиг. 1 отражает такие же результаты, как и графа, где ось X была разделена на две части (злокачественная и незлокачественная, единицы не имеют отношения), и ось Y представляет процент Р89 для каждого пациента. Горизонтальная линия представляет 54% порога. 

Пример 2. 

При другом осуществлении изобретения адекватный пластмассовый или стеклянный субстрат (пластинки для иммуноферментного анализа или пробирки) покрыт моноклональными антителами против рецептора альфа-фетопротеина в надлежащей концентрации. После того как остатки моноклональных антител были вымыты, субстрат блокируется протеином или смесью аминокислоты для предотвращения неопределенной связи, и надлежащий пробный разбавленный раствор жидкости организма пациента (сыворотка, слюна, моча и т.д.) инкубируется с нанесением субстрата в течение надлежащего периода времени. После промытия с целью удаления несвязанного пробного материала добавляется второе антитело поликлонального типа (поликлональные тела получены путем иммунизации животного и использования его сыворотки как источника антитела для реакции, в то время как моноклональные антитела получены за счет индивидуального клонирования обессмерченных клеток селезенки в культуре или пересадки в надлежащий реципиент). Данное антитело может быть соединено с надлежащим маркером или ферментом для развития цвета или другой реакции обнаружения, или анализ может начаться добавлением антивторого антитела, меченного указанной меткой или ферментом. В случае если реакция включает данное третье антитело, тогда второе антитело должно быть произведено в другом виде, а не в первом, и пересечная реакция между 1 и 3 антителами не должна быть обнаружена. Взаимодействие регистрируется надлежащим детектором, соответствующим типу реакции (цвет, проводимость, хемолюминесценция и т.д.). 

Пример 3. 

См. пример 2, но с использованием двух других поликлональных антител вместо моноклональных и антитела для 1 и 2 антител соответственно. 

Пример 4. 

См. пример 2, в котором субстратом является нитроцеллюлоза или мембрана нейлона. Реакция не измеряется прибором, но проявляется в качестве цветного пятна на субстрате. Реакция рассматривается как положительная или отрицательная невооруженным глазом. 

Пример 5. 

См. пример 2, в котором субстратом является нитроцеллюлоза или мембрана нейлона. Реакция не измеряется прибором, но проявляется в качестве цветного пятна на субстрате. Реакция рассматривается как положительная или отрицательная невооруженным глазом. 

Пример 6. 

Одно из антител в примерах 2-5 заменяется гомологичным или гетерологичным альфа-фетопротеином, который связывается с рецептором. 

Пример 7.
 

KCl при концентрации выше 0,4 М KCl диссоциирует комплексе рецептора альфа-фетопротеина, что выпускает дополнительное количество рецептора альфа-фетопротеина, который может быть не обнаружен, поскольку узнавание одним из лигандов (моноклональные антитела, поликлональные антитела или альфа-фетопротеин), описанные в предыдущем примере, могут быть ослаблены эндогенным альфа-фетопротеином, которые могут присутствовать в циркулирующих комплексах рецептора альфа-фетопротеина. В результате количество рецептора альфа-фетопротеина может быть увеличено, таким образом увеличивая чувствительность теста. В данном случае проба может быть обработана KCl до или во время инкубации с полной фазой анализа. 

Пример 8. 

Все приведенные выше примеры, в которых меткой является радиоактивный компонент (для радиоиммуноанализа и подобных технологий). 

Пример 9. 

Все приведенные выше примеры, в которых считывание анализа производится хемилюминесценцией или флюоресценцией. 

Пример 10. 

Все приведенные выше примеры, в которых считывание основано на проводимости. 

В тканевых пробах. 

Тканевая проба может быть получена и обработана несколькими способами. 

ПОЛУЧЕНИЕ:

(а) Из образцов органов, удаленных в результате хирургических вмешательств. 

(б) Мазки из секреций или других жидкостей организма или при соприкосновении (влагалищный мазок)

(с) Пункционная биопсия

Обработка ткани перед ее окраской для обнаружения рецептора альфа-фетопротеина

Тканевые пробы могут быть фиксированными или заранее подготовленные, при необходимости, различными способами:

а) Замороженные срезы. Ткань заморожена до резания. Комплемент, связывающий антитело, может быть использован или нет на данных срезах. 

б) Парафиновые срезы. В которых ткань проходит обычную подготовку с целью заделывания пробы в парафиновых блоках до резания. 

с) Акриловые и другие процессы В основном для электронной микроскопической обработки. 

Пример 11

В данном случае были использованы обычные парафинные срезы из патологического отдела больницы. Ткань была разрезана на части от 4 до 8 ед. измерения. После регидратации срезы прошли инкубацию в растворе асцитов моноклональных антител против рецептора альфа-фетопротеина, разведенного 1:2000. Через сорок пять минут предметные стекла были промыты и подвергнуты инкубации с конъюгатом перекисного соединения иммуноглобулина или меченым родамином. Через сорок пять минут срезы были промыты еще раз и были либо изучены под микроскопом с надлежащим световым источником, либо инкубированы с перекисью субстратом DAB до тех пор, пока не проявился цвет. Затем предметные стекла были подготовлены и исследованы при видимом свете. На фиг. 2-7 показаны фотографии рецептора альфа-фетопротеина, окрашенного родамином, на раке молочной железы (фиг. 2-3), доброкачественной аденоме молочной железы (фиг. 4), раке легкого (фиг. 5), раке желудка (фиг.6) и раке кишки (фиг. 7). Фигуры показывают, что раковые клетки или структуры или полосы раковых клеток положительно окрашены, в то время как доброкачественные примыкающие ткани не окрашены, что очевидно из фиг. 4, на который изображена доброкачественная аденома молочной железы. Клетки - отрицательные, и не существует разницы в окраске между клетками аденомы и примыкающими здоровыми тканями. 

Лечение рака

Экспрессия маркеров рака на поверхности раковых клеток предоставляет возможность их использования для нацеливания на раковые клетки в лечебных целях. 

Существует ряд путей, вызывающих омертвение клеток путем нацеливания на поверхностные антигены. Например, можно использовать антитела, которые фиксируют комплемент. Когда происходит цепная реакция комплемента, появляются разрывы на мембране клетки, которые ведут к омертвению клетки. Другой возможностью является использование противоопухолевых антител, соединенных с лекарственными средствами или токсинами. После присоединения к поверхности клетки конъюгаты поглощаются цитоплазмой клетки, где ферменты клетки отделяют лекарственные средства и токсины от антител. После их освобождения лекарственные средства и токсины наносят непоправимый ущерб клетке, вызывая ее омертвение. В другой ситуации могут быть использованы антитела, меченные радиоактивным изотопом. После прикрепления к клетке радиация, на коротком расстоянии от клетки ДНК, наносит ей ущерб, таким образом вызывая омертвение клетки в следующей репликации. 

Ключевым компонентом во всех описанных выше процедурах является антитело, которое узнает злокачественные клетки. Если используется рецептор альфа-фетопротеина в качестве маркера рака, тогда в качестве молекул нацеливания могут быть использованы не только антитела, но и сам альфа-фетопротеин специально узнает рецептор альфа-фетопротеина. Таким образом, альфа-фетопротеин может также быть мечен различными цитологическими антигенами, вызывающими омертвение клетки. 

Помимо разрушения раковых клеток альфа-фетопротеин может вызвать остановку пролиферации, как показано в следующем примере. 

Пример 12. 

Клетки мыши Р-388, проявляющие рецептор альфа-фетопротеина, были инкубированы в различных разведенных растворах моноклонального антитела против рецептора альфа-фетопротеина. Предварительно была проведена реакция связывания комплемента, которая показала отсутствие разрушения клетки в результате связывания комплемента. После 2-6 часовой индукции клетки Р-388 были пульсированы с 3H-тимидином, обработаны и подсчитаны. На фиг. 8 показаны радиоактивные тимидиновые подсчеты клеток, обработанных такой же концентрацией моноклонального антитела к рецептору альфа-фетопротеина или сыворотки здоровой мыши. Как изображено, пролифирация Р-388 может быть значительно сокращена моноклональными антителами. Интересно, что, когда клетки инкубированы в течение нескольких часов с моноклональными антителами, затем обработаны и помещены в культуру, частота их репликации близка к частоте регуляций, прошедших лечение с любыми антителами (сыворотка здоровой мыши), таким образом указывая на то, что клетки не убиты, но пролиферация задержана моноклональными антителами. Задержка пролиферации в искусственной среде также наблюдалась в линии клеток пищеварительного тракта LoVo человека (результаты не показаны). 

Причины для задержки пролиферации клеток неясны. Возможным объяснением может послужить версия, что альфа-фетопротеин во время эмбрионального периода способен переносить жирные кислоты в эмбриональные клетки. Такие жирные кислоты необходимы для синтезирования мембран клеток, очень активного задания во время органогенеза. Поскольку внеклеточная концентрация альфа-фетопротеина изменяется со временем и от одной ткани к другой, вступление в репликацию при неадекватной концентрации альфа-фетопротеина, окружающего клетку, может быть самоубийственным для клетки. Данная концепция поддерживает предположение, что рецептор альфа-фетопротеина может служить в качестве курьера между мембраной клетки и атомом. Антитело против рецептора альфа-фетопротеина, описанного в опытах с Р-388, может неким образом "повредить послание" к атому и, следовательно, клетка не вступает в разделение, что важно, поскольку существуют другие пути "повреждения" системы рецептора альфа-фетопротеина, использующие другие вещества помимо моноклональных антител, как мы обсудим ниже. 

Важным соображением в данном и других случаях является то, что, моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина мыши, произведенные против рецептора альфа-фетопротеина человека, также узнают раковые клетки мыши. 

Подобная пересечная реакция между видами наблюдалась при изучениях связи, когда альфа-фетопротеин одного вида прошел инкубацию и связался с клетками другого вида, таким образом предложив структурные сходства между рецепторами альфа-фетопротеина различных видов. 

Пример 13. 

Черные мыши C57 одновременно получили инъекцию 2x 106 клетки EL-4 подкожно в брюшную полость и 100 мкл асцитов к рецептору альфа-фетопротеина или сыворотки здоровой мыши в качестве регуляции в вены хвоста. По причине незначительной тканевой несовместимости животные получили облучение в 300 рад, что помогло клеткам EL-4 принять и воспроизводить опухоли. Животные находились под наблюдением на протяжении 21 дня, умерщвлены и сфотографированы. На фиг. 9 и 10 показаны результаты двух таких экспериментов. На фиг. 9 показано: вверху - 3 контрольных животных, получивших инъекцию сыворотки здоровой мыши; внизу - 4 животных, подвергнутых лечению, через 5 дней после получения инъекции. Опухоли в контрольной группе (отдельные из них окрашены красным фетром с тем, чтобы они были более очевидны) были приблизительно 5 мм диаметром. Подвергнутые лечению животные не показали признаков болезни (наблюдался только рубец на месте инъекции). На фиг. 10 показаны несколько животных из другого эксперимента, в котором все 5 подвергнутых лечению животных не показали признаков заболевания (3 из них показаны) и 2 страдают от крупных опухолей (животные были убиты через 15 дней после инъекций). 

В другом эксперименте подвергнутые лечению животные прожили на протяжении 8 месяцев без каких-либо признаков заболеваний или отклонений от нормы. 

Пробы и общая вода организма. Рецептор альфа-фетопротеина присутствует на мембране клетки, а также в цитоплазме. Когда радиоактивный альфа-фетопротеин инкубируется с раковыми клетками, приблизительно 2/3 его обнаруживаются в цитоплазме, наверняка, связанный с рецептором альфа-фетопротеина (ссылка 32, Naval, J., Villacampa, M.J., Gouel, A.F. and Uriel,. J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301, (1985)). Был разработан способ для очистки рецептора альфа-фетопротеина из сыворотки структуры человека [Moro, R., Tamaoki, Т. , Wegmann, T. G., Longenecker, В.М., and Laderoute, М.Р. Tumour Biol. 14, 116 (1993)), включенный с ссылкой. Данный способ функционален, потому что имеется версия, что существует циркулирующий рецептор альфа-фетопротеина, освобожденный от красящих клеток или активно ими выделяемый. Рецептор альфа-фетопротеина является растворимым протеином, присутствующим в крови новорожденного, как это и ожидается. 

То же самое происходит с лицом, страдающим от опухоли, только происхождением рецептора альфа-фетопротеина являются злокачественные клетки, а не эмбриональные клетки, в которых он выражается физиологически. Таким образом, внеклеточная опухолевая жидкость содержит рецептор альфа-фетопротеина. Это важно, поскольку некоторые жидкости организма или выделения могут быть непосредственно получены из внеклеточной жидкости. Например, периотонеальный карсиноматоз (раковые клетки любого происхождения, которые метастизируют в брюшину и распространяются по всей брюшной полости) обычно производит асцитную жидкость, которая была испытана и которая имеет обильное содержание рецептора альфа-фетопротеина (не путать с асцитами, вызванными в мышах в качестве источника моноклональных антител, хотя физиопатологические механизмы такие же: раковые клетки (в данном случае гибридомы, производящие моноклональные антитела) в брюшной полости вызывают воспалительную реакцию, которая производит асциты, в которые гибридомные клетки выпускают моноклональные антитела). Р89, которые использованы в качестве стандарта в данных иммуноферментных анализах, является плевральным выпотом пациента, страдающего от метастаза легкого рака молочной железы. Ситуация заключается в том, что клетки рака молочной железы перешли к легкому и начали рост на плевре, мембране, покрывающей легкие. Плевра реагирует на раковые клетки таким же образом, как и брюшина, только жидкость называется плевральным выпотом, а не асцитами. В данных случаях (асциты и плевральным выпот) раковые клетки, находящиеся в непосредственном контакте с жидкостью (или плавающие в ней), выпускают рецептор альфа-фетопротеина непосредственно в нее. 

Асциты и плевральный выпот собираются пункцией с иглой. В других случаях выделения могут появиться из тела самопроизвольно. Например, рак мочевого пузыря может выделить рецептор альфа-фетопротеина в моче, который затем может быть под наблюдением. Бронхиальный рак может выпустить рецептор альфа-фетопротеина в слизь, которая может быть собрана как мокрота, если заставить пациента откашляться. 

Если злокачественные клетки находятся в близком контакте с кровью, как в случае лейкоза и при некоторых лимфомах, тогда самая высокая концентрация рецептора альфа-фетопротеина будет в сыворотке. 

Перечисленные выше примеры являются реальными ситуациями, но не наиболее вероятными. Наиболее распространенные раки: желудка, молочной железы, матки, толстой кишки и легкого, выделяют рецептор альфа-фетопротеина в общее русло крови. Данная жидкость организма обнаружит наибольшую концентрацию маркера в жидкости, имеющейся для анализа. Тем не менее по мере того как возрастает чувствительность различных иммунохимических технологий, появляется возможность обнаружить рецептор альфа-фетопротеина в других жидкостях. Например, небольшое количество большинства сывороточных протеинов проявляется в слюне. Очевидно, что наиболее практичным будет приобретение пробы слюны, а не крови и, если количество рецептора альфа-фетопротеина достаточно высоко и чувствительность используемой реакции достаточна, можно будет использовать слюну вместо крови для диагностических целей и последующего наблюдения. То же самое распространяется на другие жидкости организма. 

В отдельных случаях удобно использовать такие жидкости организма, как асцитную, суставную жидкость (например, рак кости сустава), плевральный выпот, мокроту, цереброспинальную жидкость, мочу, кал и т.д. В некоторых случаях кровь или сыворотка являются лучшим выбором. В некоторых отдельных случаях более удобным может оказаться, по практическим или юридическим причинам, провести анализ других жидкостей организма, таких как слюна или моча, хотя большее количество рецептора альфа-фетопротеина может оказаться в сыворотке. Жидкости организма могут быть собраны из самопроизвольных выделений или пункцией надлежащей иглой. 

Иммунохимические способы. Данные способы могут быть разделены на 2 группы: произведенные в пробирке или в лунке, в которых твердой фазой, на которой "застряла" реакция, является искусственный материал, и другие, в которых твердая фаза является естественной частью хозяина, например, срез ткани или мазок кровяных клеток. Первый тип обычно называется иммунохимическим анализом, и второй называется иммуногистохимическим (в случае среза ткани) или иммуноцитохимическим (когда клетки нефиксированы, как в мазке) технологиями. Их принципы идентичны, первоначальные материалы различны. Для иммунохимического анализа молекула, подлежащая обнаружению или измерению, должна быть в растворе, в то время как при иммуногистохимическом или иммуноцитохимическом анализах молекула исследования является частью клетки, вовлеченной в реакцию. 

Общий принцип данных реакций прост. Антитела (моноклональные, или из сыворотки, или прошедшие иммунизацию животные) очень специфичны при опознании структуры, против которой они вступают в реакцию. Если животное было иммунизировано очень чистыми фракциями альбумина человека, его сыворотка признает только высокие концентрации сотен других протеинов. Антитела также имеют родство с веществами, против которых они появились (называемыми антигенами). Таким образом, небольшие количества таких антигенов могут быть обнаружены. 

Иммунохимические и иммуногистохимические (иммуноцитохимические реакции включаются с иммуногистохимическими, поскольку единственным различием является то, что в одном случае клетки являются частью структуры ткани, которая была разрезана и помещена на предметное стекло, и в другом случае клетки были распространены по предметному стеклу) реакции проводятся одинаково: вещество (антиген), подлежащее обнаружению (в данном случае рецептор альфа-фетопротеина), вступает в реакцию с антителом, которое специфично для данного антигена. Один из них (антитело или антиген) каким-то образом мечены. После их совместной инкубации избыточный реактив вымывается, и в доказательство различными путями помещается метка. Если меткой является радиоизотоп, тогда подсчет радиоактивных единиц измеряется надлежащим детектором. Обычно Обычно 125I используется для данных технологий и измеряется - -излучение. Данные способы группируются под названием радиоиммунный анализ. Если инкубация с радиоактивной меткой произведена на срезе ткани, тогда предпочитается 3H, и он проявляется на предметном стекле после его покрытия фотографической эмульсией. Серебряные зерна (черные) появляются на месте радиоактивности. Данные зерна могут наблюдаться под микроскопом.

Другой довольно популярный способ использует фермент в качестве метки. Фермент является катализатором, поэтому он может превратить субстрат в новый продукт. Интересным моментом является то, что 1 единичная молекула фермента, такая как перекисное соединение ложечницы приморской или щелочная фосфатаза (2 наиболее широко используемых) могут обработать 10000 или более молекул субстрата. Таким образом, чувствительность значительно увеличивается, поскольку присутствует коэффициент амплификации 10000. Данные реакции известны под названием иммуноферментный анализ или иммуноферментный твердофазный анализ. Данные ферменты обычно производят изменения цвета в субстрате. В растворимых пробах (иммунохимические реакции) раствор в пробирке или лунке изменяет цвет и следовательно, измерив изменение, можно определить количество реакции (используя фотоколориметр или спектрофотометр). В других случаях фермент выделяет ионы из неионического раствора, таким образом изменяя электрическую проводимость раствора, которая может затем измеряться электрически. При данных различных способах метка - биотин, который опознается авидином, соединенным с ферментом. Реакция авидин-биотин увеличивает общую чувствительность анализа. 

В последнее время был представлен другой тип метки. Данными метками являются флюорохромы, которые, возбудившись под ультрафиолетовым излучением, излучают фотоны в спектре видимого излучения. Реакции измеряются с фотоэлементом непосредственно после облучения высокоинтенсивным ультрафиолетовым стимулирующим импульсом. Данные способы известны в качестве иммунохемилюминесценции. 

Независимо от того, как были мечены молекулы или считаны реакции, реакции проводятся в хорошо определенной последовательности, описанной ниже. 

Конкурентные анализы. В данном случае свободный антиген (здесь рецептор альфа-фетопротеина) должен быть получаем в относительно крупных количествах и в очень чистой форме. Антитело присоединено к твердой фазе (пробирка, или пластмассовая лунка, или надлежащая мембрана). Проба, содержащая антиген, смешивается с известным количеством чистого меченого антитела. Смесь подвергается инкубации с антителом на твердой фазе. Чем больше количество антител в первоначальной пробе, тем меньше меченых антител может присоединиться к данному количеству антител на твердой фазе (количество антигенов насыщено по сравнению с количеством антител). Реакция подсчитывается экстраполяцией против раствора, содержащего известное количество немеченого антигена. Данный способ работает только с растворимыми антигенами, он не используется с пробами ткани. Главным преимуществом конкурентного анализа является то, что для них требуется только одно антитело. 

Способы "бутерброд". Существуют различные варианты: традициональный бутерброд иммуноферментного твердофазного анализа состоит из химического присоединения одного антитела к твердой фазе. Затем добавляется проба, содержащая подлежащий измерению антиген. Разведения такие, что реакция начинается в избытке антител. После инкубации в течение нескольких минут или нескольких часов избыточные реактивы вымываются и добавляется второе антитело. Данное второе антитело должно узнать участок на молекуле антигена, отличном от участка, узнанного первым антителом. В противном случае участок будет занят 1 антителом и реакции не произойдет (за исключением того, если антиген имеет более одного идентичного связующего участка, которые будут узнаны 2 антителом, редкий случай). Второе антитело также присутствует в избытке, поэтому все антигены узнаны. Данное 2 антитело метится. После повторной обработки считывается реакция. Способы бутерброда имеют одно преимущество, которое заключается в том, что нет необходимости в чистом антигене. Невыгодными факторами являются: большее количество времени на реакцию (необходимы минимально 2 инкубации) и необходимость использования 2 различных антител. 

"Открытый бутерброд" был использован в данном примере, он также используется в большинстве иммуногистохимических реакциях на ткани. В данном случае антиген зафиксирован на твердой фазе, и меченое антитело (только 1 антитело) подвергается на ней инкубации. Невыгодным фактором при использовании пробирки в качестве твердой фазы является то, что то, как антиген прилипает к пробирке, может оказать влияние на интенсивность реакции и "липкость" может зависеть от других компонентов пробы, которые отличаются в зависимости от сыворотки одного пациента от другого (потому что силы, способствующие связи протеинов к стеклу или пластмассе пробирки или лунки, электростатические и слабые по своей природе по сравнению с сильными реакциями, связующими антиген с антителом). "Закрытый бутерброд", описанный выше, функционирует при избытке 1 антитела. Тогда насколько 1 антитело прилипает к твердой фазе неважно, и не существует различий между пробами, поскольку неспецифичное связывание к твердой фазе всегда использует точно такой же продукт, как анализ (подготовка 1 антитела). Различие между страдающими и нестрадающими от раковых заболеваний пациентами в рамках данных экспериментов не могло быть объяснено различиями в покрытии используемых пластмассовых пластинок. 

О твердой фазе. Она может быть тканью на микроскопическом аппарате или надлежащей поверхности, к которой прикрепляются молекулы, обычно электростатистической силой (препарат обычно инкубируется в течение нескольких часов в пробирках, которые после этого промываются). В других случаях, тем не менее, твердой фазой может быть мембрана, обычно нейлоновая или нитроцеллюлозная. Данные мембраны белые. Если мембрана покрыта антителом или антигеном, тогда проводится анализ, подобный проведенному на микроскопических срезах ткани, и цвет проявляется с использованием субстрата, который вместо изменения цвета создает окрашенный осадок, и в конце процесса окрашенное пятно указывает, оказалась ли реакция положительной или нет. Если цвет присутствует, тогда была реакция, если цвет отсутствует, реакция была отрицательной. Это пример реакции типа "все или ничего", упомянутой ранее. Она имеет огромные превосходства, не требует аппарата для считки, достаточно невооруженного взгляда. Основным пагубным фактором является то, что она не очень точна. 

Введение антител в организм человека. Существуют различные пути подвержения воздействия антител рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента. Одним из них является введение очищенных моноклональных антител мыши в организм пациента. Если злокачественные клетки находятся в непосредственном контакте с кровью (например, лейкоз), тогда избирается внутривенный путь. То же самое происходит, если опухоль достигается только через кровь. Существуют отдельные случаи, когда другие способы могут быть лучшими. Как было сказано выше, отдельные опухоли растут в ограниченных пространствах, таких как плевральная полость или брюшинная полость. В данных случаях введение антител непосредственно в полость, а не в общее русло крови, может оказаться лучшим. Другим путем доставления антител против рецептора альфа-фетопротеина является их стимуляция в хозяине. Страдающий от раковых заболеваний пациент мог быть иммунизирован рецептором альфа-фетопротеина другого вида. Незначительные различия между структурой рецепторов человека или других видов могут позволить произвести антитела в данном пациенте, которые, даже если они направлены против, например, мышиного или бычьего рецептора альфа-фетопротеина, могут вступить в перекрестную реакцию с собственным рецептором альфа-фетопротеина человека. Таким образом, пациент получает вакцину против своей собственной опухоли. Стоит отметить, что антитела не являются единственным путем "защемлять" рецептор на поверхности раковых клеток. Денатурированный альфа-фетопротеин может достичь такой же цели. Даже синтетический кусок альфа-фетопротеина может получить такой же результат и, следовательно, может быть использован для остановки роста опухоли. 

Существуют различные пути получения модифицированного альфа-фетопротеина, любых частей естественного альфа-фетопротеина или частей, синтезированных молекулярной инженерией из ДНК. Ключом является порция альфа-фетопротеина, вступающая в реакцию с жизнеспособным рецептором альфа-фетопротеина, но остающаяся порция альфа-фетопротеина либо отсутствует, либо изменена, либо значительно повреждена так, что она не способна функционировать. Данные пути хорошо известны. Например, они используют полипептидный синтезатор Beckman Instruments для получения синтетической части альфа-фетопротеина, которая вступает в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина. Последовательность аминокислоты, соответствующая части альфа-фетопротеина, вступающего в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина, вводится в полипептидный синтезатор, и синтезатор активируется. Синтезированный полипептид является результатом. Также часть альфа-фетопротеина может быть синтезирована с введением желаемой последовательности ДНК в систему хозяина через надлежащий переносчик, что хорошо известно в данной области. Затем система хозяина проявляет часть альфа-фетопротеина, которая затем собирается и поддается очистке при желании. Или трансгенный синтез может быть использован, поместив желаемую последовательность ДНК, например, в оплодотворенное коровье яйцо. Желаемая часть альфа-фетопротеина получается от животного после его рождения, как хорошо известно в данной области. См., например, Маниатис и др. (1982). Другой путь получения желаемого альфа-фетопротеина достигается разрезанием естественного альфа-фетопротеина. Альфа-фетопротеин делится цепным реактивом, таким как бромциан аниона, и затем очищается для получения желаемой части альфа-фетопротеина. 

Хотя изобретение было подробно описано с целью его иллюстрации, необходимо учесть, что подробности приводятся исключительно с этой целью и специалистами в данной области могут быть внесены изменения, не отдаляясь от сущности и сферы изобретения, описанных далее в формуле изобретения. 

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ обнаружения рака у пациента, включающий стадии введения меченых антител против рецептора альфа-фетопротеина или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина или связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе, определения рецептора альфа-фетопротеина или связующих участков рецептора альфа-фетопротеина в биологическом материале, которые вступили в реакцию с мечеными антителами или меченым альфа-фетопротеином, для определения наличия рака. 

2. Способ по п.1, где стадия введения включает стадию введения антител, меченых радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченого радиоизотопом, в биологическую пробу пациента для того, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. 

3. Способ по п.1, где стадия введения включает стадию введения антител, меченых ферментом, или альфа-фетопротеина, меченого ферментом, в биологическую пробу пациента для того, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. 

4. Способ по п.1, где стадия введения включает стадию введения антител, меченых флуорохромом, или альфа-фетопротеина, меченого флуорохромом, в биологическую пробу пациента для того, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. 

5. Способ по п.4, где стадия введения включает стадию инъецирования непосредственно пациенту антитела, меченого радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченого радиоизотопом. 

6. Способ по п.4, где стадия введения включает стадию помещения капли биологической пробы на участок на нитроцеллюлозе или на нейлоне и добавления антитела, меченого перекисным соединением, и стадия определения включает стадию определения того, изменил ли участок на нитроцеллюлозе или на нейлоне цвет. 

7. Способ по п. 4, где меченое ферментом антитело и меченый ферментом альфа-протеин выделяют ионы, которые изменяют электрическую проводимость раствора, в который помещается биологическая проба, и стадия определения включает стадию измерения электрической проводимости раствора для определения наличия рака в биологической пробе. 

8. Способ по п.1, где антителами являются моноклональные или поликлональные антитела. 

9. Способ по п.1, где биологической пробой является кровь, слюна, ткань, сыворотка, мокрота, моча, слезная жидкость или материал, содержащий раковые клетки. 

10. Способ по п.1, где биологической пробой является срез ткани. 

11. Способ по п.1, где биологической пробой является мазок биологического материала, содержащий раковые клетки, на предметном стекле, и стадия определения включает стадию изучения мазка под микроскопом или флюроцитометрией. 

12. Способ угнетения роста или омертвления раковых клеток пациента, включающий введение антител рецептора альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента для взаимодействия с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток. 

13. Способ по п.12, где стадия введения включает стадию инъецирования пациенту антител к рецептору альфа-фетопротеина. 

14. Способ по п.12, где стадия введения включает стадию вакцинации пациента против раковых клеток. 

15. Способ по п.14, где стадия вакцинации включает стадию инъекции рецептора альфа-фетопротеина другого вида, а не пациента, в пациента для того, чтобы организм пациента произвел антитела рецептора альфа-фетопротеина против введенного рецептора альфа-фетопротеина, указанные антитела рецептора альфа-фетопротеина, произведенные организмом пациента, также вступают в перекрестную реакцию с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток пациента. 

16. Способ по п.12, где стадия реакции включает стадию реакции рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с антителами рецептора альфа-фетопротеина для того, чтобы рецептор альфа-фетопротеина раковых клеток был блокирован или его функциональность была нарушена. 

17. Способ по п.12, где антитела рецептора альфа-фетопротеина соединяются с лекарственными средствами или токсинами и стадия реакции включает стадию реакции антител рецептора альфа-фетопротеина, соединенного с лекарственными средствами или токсинами, с раковыми клетками для того, чтобы раковые клетки поглотили лекарственные средства или токсины, где ферменты раковых клеток освободили лекарственные средства и токсины от антител, нанося непоправимый ущерб клеткам и вызывая их омертвление. 

18. Способ по п.12, где антитела рецептора альфа-фетопротеина мечены радиоактивным изотопом и стадия реакции включает стадию реакции меченых радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина с раковыми клетками пациента, чтобы радиация меченых радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина на короткой дистанции от ДНК раковых клеток повредила ДНК, таким образом вызвав омертвление раковых клеток. 

19. Способ по п.12, где антитела - моноклональные, поликлональные антитела, отличные от антител пациента, или антитела, полученные в искусственных условиях из лимфоцитов пациента. 

20. Способ наблюдения за пациентом, страдающим раковым заболеванием, включающий стадии лечения пациента от раковых заболеваний и обследования пациента в заранее отведенные сроки и после лечения уровней альфа-фетопротеиновых рецепторных участков. 

21. Способ лечения пациента, включающий стадии проведения тестов на рецептор альфа-фетопротеина у пациента, введения антител рецептора альфа-фетопротеина или альфа-фетопротеина пациенту для их реакции с раковыми клетками пациента, если тесты указывают на наличие рецептора альфа-фетопротеина у пациента. 

22. Способ угнетения роста или омертвления раковых клеток пациента, включающий введение модифицированного альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента для взаимодействия с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток. 

23. Способ по п.22, где стадия реакции включает стадию реакции рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с модифицированным альфа-фетопротеином, чтобы участки рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток были блокированы или их функциональность была нарушена. 

24. Способ по п.22, где модифицированный альфа-фетопротеин производится синтетически или является частью альфа-фетопротеина. 

Версия для печати
Дата публикации 25.05.2007гг


вверх