ЛЕЧЕНИЕ В-КЛЕТОЧНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ CD40L В КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ CD20 И/ИЛИ ХИМИОТЕРАПИЕЙ И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ

ЛЕЧЕНИЕ В-КЛЕТОЧНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ CD40L В КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ CD20 И/ИЛИ ХИМИОТЕРАПИЕЙ И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ


RU (11) 2305561 (13) C2

(51) МПК
A61K 39/395 (2006.01)
A61K 51/10 (2006.01)
A61P 35/02 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - нет данных 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.09.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002115285/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.11.06 
(30) Приоритетные данные: 09/435,992 1999.11.08 пп.1-88 US 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.11.06 
(43) Дата публикации заявки: 2003.12.27 
(45) Опубликовано: 2007.09.10 
(56) Аналоги изобретения: US 5674492, 07.10.1997, кол.1, строки 10-16, кол.11, строки 50-67, кол.12, строки 1-5. WO 98/39026 A2, 11.09.1998, с.1, строки 10-16, с.3, строки 5-15, с.6 полностью. US 5843398, 01.12.1998, п.1 формулы, столб. 12, строки 20-26, столб. 15-18 - таблица 1. Benoit N.E. et al. Increased inhibition of proliferation of human В cell lymphomas following
ligation of CD40, and either CD19, CD20, CD95 or surface immunoglobulin // Immunopharmacology. 1996 Nov; 35(2):129-39, abstr. PubMed на сайте http://www.pubmed.com. KITADA S. ET AL. Bryostatin and CD40-ligand enhance apoptosis resistance and induce expression of cell survival genes in B-cell chronic lymphocytic leukaemia // Br.J.Haematol.1999 Sep; 106(4):995-1004, abstract PubMed. Противоопухолевая химиотерапия./ Под ред. проф. Н.И.Переводчиковой. - М.: Медицина, 1986, с.101-118.

(72) Имя изобретателя: ХАННА Набил (US); ХАРИХАРАН Кандасами (US) 
(73) Имя патентообладателя: БАЙОДЖЕН АЙДЕК ИНК. (US) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2002.06.10 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 00/30426 (06.11.2000) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 01/34194 (17.05.2001) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег.№ 517 

(54) ЛЕЧЕНИЕ В-КЛЕТОЧНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ CD40L В КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ CD20 И/ИЛИ ХИМИОТЕРАПИЕЙ И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ
Изобретение относится к медицине, онкологии, и характеризует композиции, их применение и варианты способа лечения В-клеточных лимфом, лейкозов, а также других злокачественных опухолей CD40 +. Основным активным терапевтическим агентом является анти-СD40L-антитело или другой антагонист CD40L, который ингибирует взаимодействие CD40-CD40L. В комбинации или композиции с указанным антагонистом CD40L могут дополнительно использоваться любой один или несколько из следующих компонентов: анти-СD20-антитело, химиотерапевтическое средство или их комбинация, лучевая терапия. Изобретение обеспечивает усиление механизмов апоптоза CD40+ клеток опухоли за счет сенсибилизации этих ранее резистентных клеток к гибели. 6 н. и 82 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Область изобретения

Изобретение относится к способу терапии и комбинированной терапии для лечения В-клеточных лимфом и лейкозов, а также других злокачественных опухолей CD40 +, путем регулирования взаимодействия между CD40 и его лигандом, CD40L, или регулирования передачи сигнала через CD40. В частности взаимодействие можно ингибировать с использованием антител против CD40L, чтобы предотвратить связывание CD40L с CD40. Указанные антитела или другие агенты, которые могут ингибировать взаимодействие CD40/CD40L, кроме того, можно комбинировать с химиотерапией, облучением и/или антителами против CD20 и антителами против CD40.

Предпосылки изобретения

Лимфомы представляют собой опухоли лимфоцитов. Девяносто процентов лимфом имеет В-клеточное происхождение, оставшиеся десять процентов лимфом Т-клеточного происхождения. У большинства пациентов диагностируют либо болезнь Ходжкина (БХ), либо лимфому неходжскинского типа (НХЛ).

В зависимости от диагностированной лимфомы варианты лечения включают в себя лучевую терапию, химиотерапию и применение моноклональных антител.

А. Антитела против CD20.

CD20 является антигеном клеточной поверхности, экспрессируемым более чем на 90% В-клеточных лимфом, который не исчезает и не модулируется в неопластических клетках (McLaughlin et al., J. Clin. Oncol. 16: 2825-2833 (1998b)). Антиген CD20 является негликозилированным мембранным белком В-клеток с молекулярной массой 35 кДа, вовлеченным во внутриклеточную передачу сигнала, дифференцировку В-клеток и мобилизацию кальциевых каналов (Clark et al., Adv. Cancer Res. 52: 81-149 (1989); Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994)). Антиген появляется как ранний маркер дифференцировки В-клеточной линии и повсеместно экспрессируется с разной антигенной плотностью как на нормальных, так и на злокачественных популяциях В-клеток. Однако антиген отсутствует на полностью зрелых В-клетках (например, плазматических клетках), ранних популяциях В-клеток и стволовых клетках, что делает его подходящей мишенью для опосредованной антителами терапии.

Были получены антитела против CD20 для применения как в исследовательской работе, так и в терапии. Одно антитело против CD20 представляет собой моноклональное антитело В1 (патент США № 5843398). Антитела против CD20 также были получены в форме радионуклидов для лечения В-клеточной лимфомы (например, антитело против CD20, меченное 131I), а также в форме, меченной 89Sr, для облегчения болей в костях, вызываемых метастазами при раке простаты и молочной железы (Endo, Gan To Kagaku Ryoho 26: 744-748 (1999)).

Мышиное моноклональное антитело 1F5 (антитело против CD20), по имеющимся сообщениям, вводили путем непрерывной внутривенной инфузии пациентам с В-клеточной лимфомой. Однако, судя по сообщениям, требовались чрезвычайно высокие уровни (>2 грамм) 1F5, чтобы уменьшить количество циркулирующих опухолевых клеток, и результат был описан как «временный» (Press et al., Blood 69: 584-591 (1987)). Возможная проблема при использовании моноклональных антител в терапии заключается в том, что у моноклональных антител не человека, а животных (например, мышиных моноклональных антител), обычно отсутствуют эффекторные функции антитела человека, например, кроме прочего, они не способны опосредовать комлементзависимый лизис или лизировать клетки-мишени человека за счет антителозависимой клеточной токсичности или опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза. Кроме того, моноклональные антитела не человека, а животных, могут распознаваться хозяином-человеком как чужеродный белок; поэтому повторные инъекции таких чужеродных антител могут привести к индукции иммунных ответов, приводящих к опасным реакциям гиперчувствительности. Для моноклональных антител, полученных на основе мышей, это явление часто называют ответом на основе выработки антимышиных антител у человека или ответом «НАМА». Кроме того, указанные «чужеродные» антитела могут быть атакованы иммунной системой хозяина так, что в действительности они нейтрализуются до того, как достигнут места своей мишени.

RITUXAN® . RITUXAN® (также известный как Rituximab, MabThera®, IDEC-C2B8 и С2В8) было первым одобренным FDA моноклональным антителом и было разработано в IDEC Pharmaceuticals (см. патенты США № 5843439; 5776456 и 5736137) для лечения В-клеточной лимфомы человека (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)). RITUXAN® является химерным моноклональным антителом (МАт) против CD20, которое ингибирует рост и, по имеющимся сообщениям, сенсибилизирует некоторые линии клеток лимфомы в отношении апоптоза под действием химиотерапевтических средств in vitro (Demidem et al., Cancer Biotherapy and Radiophannaceuticals 12: 177-(1997)). RITUXAN ® также проявляет противоопухолевую активность при тестировании in vivo с использованием животных моделей ксенотрансплантатов мыши. RITUXAN® эффективно связывается с комплементом человека, обладает прочным связыванием с FcR и может эффективно убивать лимфоциты человека in vitro посредством как зависимого от комплимента (CDC), так и антителозависимого (ADCC) механизмов (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)). У макак антитело избирательно истощает количество нормальных В-клеток в крови и лимфатических узлах.

RITUXAN® было рекомендовано для лечения пациентов с неходжкинской лимфомой низкой степени злокачественности или фолликулярной В-клеточной неходжкинской лимфомой (McLaughlin et al., Oncology (Huntingt) 12: 1763-1777 (1998a); Maloney et al., Oncology 12: 63-76 (1998); Leget et al., Curr. Opin. Oncol. 10: 548-551 (1998)). В Европе RITUXAN® было одобрено для терапии рецидивирующей фолликулярной лимфомы на стадии III/IV (White et al., Pharm. Sci. Technol. Today 2: 95-101 (1999)) и, по имеющимся сообщениям, эффективно против лимфомы клеток фолликулярных центров (FCC) (Nguyen et al., Eur. J. Haematol 62: 76-82 (1999)). Другие расстройства, которые лечат RITUXAN®, включают в себя лимфому клеток фолликулярных центров (FCC), лимфому из мантийных клеток (MCL), диффузную лимфому из крупных В-клеток (DLCL) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/хронический лимфоцитарный лейкоз (SSL/CLL) (Nguyen et al., 1999)). Пациенты с трудноизлечимой или неизлечимой НХЛ, по имеющимся сообщениям, реагировали на комбинированную терапию RITUXAN® и CHOP (например, циклофосфамид, винкристин, преднизон и доксорубицин) (Ohnishi et al., Gan To Kagaku Ryoho 25: 2223-8 (1998)). RITUXAN ® проявило минимальную токсичность и значительную терапевтическую активность при неходжкинских лимфомах (НХЛ) низкой степени злокачественности в клинических исследованиях I и II фазы (Berinstein et al., Ann. Oncol. 9: 995-1001 (1998)).

RITUXAN®, которое использовали отдельно для лечения В-клеточных НХЛ обычно в еженедельной дозе 375 мг/м2 в течение четырех недель при рецидивирующей или трудноизлечимой НХЛ низкой степени злокачественности или фолликулярной НХЛ, хорошо переносилось и обладало значительной клинической активностью (Piro et al., Ann. Oncol. 10:655-61 (1999); Nguyen et al., (1999); и Coiffer et al., Blood 92: 1927-1932 (1998)). Однако в ходе испытаний с использованием антитела также вводили дозы до 500 мг/м2 в течение четырех недель (Maloney et al., Blood 90: 2188-2195 (1997)). RITUXAN ® также комбинировали с химиотерапевтическими средствами, такими как CHOP (например, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон), для того, чтобы лечить пациентов с неходжкинской лимфомой низкой степени злокачественности или фолликулярной В-клеточной неходжкинской лимфомой (Czuczman et al., J. Clin. Oncol. 17: 268-76 (1999); и McLaughlin et al., (1998a)).

B. CD40 и CD40L.

CD40 экспрессируется на клеточной поверхности зрелых В-клеток, а также лейкозных и лимфоцитарных В-клетках и на клетках Ходжкина и Рид-Стернберга (PC) при болезни Ходжкина (БХ) (Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463-1467 (1989); и Gruss et al., Leuk. Lymphoma 24: 393-422 (1997)). CD40 является рецептором В-клеток, приводящим к активации и выживанию нормальных и злокачественных В-клеток, таких как клетки неходжкинской фолликулярной лимфомы (Johnson et al., Blood 82: 1848-1857 (1993); и Metkar et al., Cancer Immunol. Immunother. 47: 104 (1998)). Передача сигнала через рецептор CD40 защищает незрелые В-клетки и В-клеточные лимфомы от апоптоза, индуцированного IgM или Fas (Wang et al., J. Immunology 155: 3722-3725 (1995)). Сходным образом клетки лимфомы мантийных клеток имеют высокий уровень CD40, и добавление экзогенного CD40L повышало их выживаемость и спасало их от апоптоза, индуцированного флударабином (Clodi et al., Brit. J. Haematol. 103: 217-219 (1998)). Напротив, другие авторы сообщали, что стимуляция CD40 может ингибировать неопластический рост В-клеток как in vitro (Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794 (1994)), так и in vivo (Murphy et al., Blood 86: 1946-1953 (1995)).

Антитела против CD40 (см. патенты США № 5874082 и 5667165), вводимые мышам, увеличивали выживаемость мышей с В-клеточными лимфомами человека (Funakoshi et al. (1994); и Tutt et al., J. Immunol. 161: 3176-3185 (1998)). Способы лечения неоплазм, включая В-клеточные лимфомы и EBV-индуцированные лимфомы с использованием анти-CD40-антител, имитирующих эффект CD40L и, следовательно, доставляющих сигнал смерти, описаны в патенте США № 5674492 (1997), который включен в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Передача сигнала через CD40 также связана с синергическим взаимодействием с CD20 (Ledbetter et al., Circ. Shock 44: 67-72 (1994)). Дополнительные ссылки, описывающие получение и применение анти-CD40-антител, включают в себя патенты США № 5874085 (1999), 5874082 (1999), 5801227 (1998), 5674492 (1997) и 5667165 (1997), которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

Лиганд CD40, gp39 (также называемый лигандом CD40, CD40L или CD154), экспрессируется на активированных, но не на покоящихся Th-клетках CD4+ (Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol. 22: 2573-2578 (1992) и Roy et al., J. Immunol. 151: 1-14 (1993)). Как CD40, так и CD40L были клонированы и охарактеризованы (Stamenkovi et al., EMBO J. 8: 1403-1410 (1989); Armitage et al., Nature 357: 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175: 1091-1101 (1992); и Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4313-4321 (1992)). CD40L человека также описан в патенте США № 5945513. Клетки, трансфицированные геном CD40L и экспрессирующие белок CD40L на своей поверхности, могут запускать пролиферацию В-клеток и вместе с другими стимулирующими сигналами могут индуцировать продукцию антител (Armitage et al. (1992); и патент США № 5945513). CD40L может играть важную роль в зависимом от клеточных контактов взаимодействии опухолевых В-клеток (CD40+) с неопластическими фолликулами или клетками Рид-Стернберга (CD40+) в областях поражения болезнью Ходжкина (Carbone et al., Am. J. Pathol. 147: 912-922 (1995)). Моноклональные антитела против CD40L, по имеющимся сообщениям, эффективно использовали для того, чтобы ингибировать индукцию мышиного СПИД (MAIDS) у мышей, инфицированных LP-BM5 (Green et al., Virology 241: 260-268 (1998)). Однако механизм передачи сигнала CD40L-CD40, приводящего к выживанию вместо ответов в виде клеточной гибели злокачественных В-клеток, неизвестен. Например, в клетках фолликулярной лимфомы понижающая регуляция индуцирующей апоптоз молекулы TRAIL (APO-2L) (Ribeiro et al., British J. Haematol. 103: 684-689 (1998)) и сверхэкспрессии BCL-2, и в случае B-CLL, понижающая регуляция CD95 (Fas/APO-1) (Laytragoon-Lewin et al., Eur. J. Haematol. 61: 266-271 (1998)), были предложены в качестве механизмов выживания. Напротив, относительно фолликулярной лимфомы существует доказательство того, что активация CD40 приводит к повышающей регуляции TNF (Worm et al., International Immunol. 6: 1883-1890 (1994)), молекул CD95 (Plumas et al., Blood 91: 2875-2885 (1998)).

Также были получены анти-CD40-антитела для того, чтобы предупреждать или лечить опосредованные антителами заболевания, такие как аллергии и аутоиммунные заболевания, как описано в патенте США № 5874082 (1999). Анти-CD40-антитела, по имеющимся сообщениям, эффективно комбинировали с анти-CD20-антителами, получая аддитивное действие в ингибировании роста неходжкинских В-клеточных лимфом в культуре клеток (Benoit et al., Immunopharmacology 35: 129-139 (1996)). Исследования in vivo на мышах, по сути, показали, что анти-CD20-антитела были более эффективными, чем анти-CD40-антитела, введенные отдельно, при стимуляции выживания мышей, несущих некоторые, но не все, линии лимфом (Funakoshi et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101 (1996)). Анти-СВ19-антитела, по имеющимся сообщениям, также эффективны in vivo при лечении двух В-клеточных лимфом сингенных мышей, BCL1 и А31 (Tutt et al. (1998)). Также описаны антитела к CD40L для применения при лечении расстройств, связанных с активацией В-клеток (Европейский патент № 555880 (1993)). Анти-CD40L-антитела включают в себя моноклональные антитела 3Е4, 2Н5, 2Н8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 и 89-79, которые описаны в патенте США № 57474037 (1998), и анти-CD40L-антитела, описанные в патенте США № 5876718 (1999), используемые для лечения болезни «трансплантат против хозяина».

Следовательно, не противореча тому, что сообщалось в литературе ранее, можно говорить о необходимости в улучшении способов лечения и комбинированной терапии для лечения В-клеточных лимфом и лейкозов. Применение композиций, содержащих анти-CD40L-антитела и другие агенты, которые противодействуют взаимодействиям CD40-CD40L, открывает новый путь лечения раковых пациентов, который может быть менее токсичным, чем существующая терапия. В частности, предложенные способы и композиции для ингибирования стимуляции CD40, чтобы предотвратить превращение раковых клеток в невосприимчивые к запрограммированной клеточной гибели, вызванной химиотерапией или другими способами терапии рака, открывает ранее неизвестный способ усиления терапии рака и снижения вероятности, что развивающиеся клетки будут резистентными к терапии.

Сущность изобретения

Объектом изобретения является способ лечения В-клеточных лимфом, В-клеточных лейкозов и других злокачественных опухолей CD40+, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, который связывается с CD40L. В-клеточные лимфомы включают в себя лимфому Ходжкина и неходжкинские лимфомы любой степени.

Другим объектом изобретения является комбинированная терапия для лечения В-клеточной лимфомы или В-клеточного лейкоза, включающая в себя анти-CD40L-антитело или фрагмент антитела или антагонист CD40L и по меньшей мере один из нижеперечисленных компонентов: (а) химиотерапевтическое средство или комбинацию химиотерапевтических средств, (b) лучевую терапию, (с) анти-CD20-антитело или его фрагмент и (d) анти-CD40-антитело или его фрагмент.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Чувствительность клеток В-лимфомы к адриамицину после 4 часов экспозиции.

Фиг.2. (Панель А) Анти-CD40L (IDEC-131) отменяет опосредованную CD40L резистентность клеток В-лимфомы к гибели под действием ADM. (Панель В) Влияние RITUXAN® на нормальные и предварительно обработанные SCD40L клетки DHL-4.

Фиг.3. (Панель А) Блокирование опосредованного CD40L выживания клеток B-CLL с помощью анти-CD40L-антитела (IDEC-131). (Панель В) Блокирование опосредованного CD40L выживания B-CLL с помощью С2В8 IDEC.

Фиг.4. FACS-анализ, сравнивающий экспрессию HLA-DR в клетках CD19+-CLL, культивируемых с sCD40L, и клетках, не культивируемых с sCD40L.

Подробное описание изобретения

В другом аспекте изобретение относится к композиции для лечения лейкозов и лимфом, а также других злокачественных опухолей, которые экспрессируют CD40. Предпочтительным вариантом изобретения являются композиции и способы их применения для лечения лимфом и лейкозов В-клеточной линии. Композиции могут содержать средства, которые антагонистическим образом действуют на передачу сигнала посредством CD40 или на взаимодействие между CD40 и CD40L. Средства необязательно могут содержать один активный агент, такой как анти-CD40L-антитело или его фрагмент, а также пептидные фрагменты, пептидные миметики или химические соединения. В альтернативном случае композиция может содержать несколько активных агентов, виды мишеней которых при злокачественных опухолях иные, чем передача сигнала через CD40 или взаимодействие CD40/CD40L, такие как химиотерапевтические средства, другие антитела, и/или композицию можно вводить в комбинации с лучевой терапией.

А. Определения.

В используемом здесь смысле подразумевается, что термин «CD40L-антитело» включает в себя иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфично реагируют с белком CD40L или его пептидом, или слитым белком CD40L. Антитела к CD40L могут включать в себя антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела и гуманизированные антитела.

В используемом здесь смысле под термином «CD40-антитело» подразумевается, что он включает в себя иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфично реагируют с белком CD40 или его пептидом, или слитым белком CD40. Антитела к CD40 могут включать в себя антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела и гуманизированные антитела.

В используемом здесь смысле под «CD20-антителом» подразумевается, что термин включает в себя иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфично реагируют с белком CD20 или его пептидом, или слитым белком CD20. Антитела к CD20 могут включать в себя антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела и гуманизированные антитела. К анти-CD20-антителам относится моноклональное антитело В1 и RITUXAN® .

Под «гуманизированным антителом» подразумевается антитело, полученное из антитела не человека, а животного, обычно мышиного антитела, которое сохраняет или в значительной степени сохраняет антигенсвязывающие свойства исходного антитела, но которое менее иммуногенно у людей. Это может быть достигнуто разными способами, включая (а) пересадку полных вариабельных доменов антитела не человека на константные области антитела человека, чтобы создать химерные антитела; (b) пересадку только районов, определяющих комплементарность (CDR), антитела не человека к каркасным и константным участкам антитела человека с сохранением или без сохранения критических остатков каркаса и (с) трансплантацию полных вариабельных доменов антитела не человека, но при этом осуществляется их «маскировка» участками, подобными участкам антитела человека, путем замены поверхностных остатков. Такие способы раскрыты у Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-5 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498 (1991); и Padlan, Molec. Immun. 31: 169-217 (1994), все работы включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Гуманизированные анти-CD40L-антитела можно получить, как описано в заявке на выдачу патента США № 08/554840, поданной 7 ноября 1995 г., также включенной в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

Под термином «антитело человека» подразумевается антитело, содержащее полностью человеческие легкую и тяжелую цепь, а также константные области, получаемое любым из известных стандартных способов.

Под «приматизированным антителом» понимается рекомбинантное антитело, которое было сконструировано так, чтобы оно содержало вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела обезьяны (или другого примата), в частности антитела макаки крабоеда, и которое содержит последовательности константных доменов антитела человека, предпочтительно константного домена иммуноглобулина человека гамма 1 или гамма 4 (или вариант РЕ). Получение таких антител описано у Newman et al., Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); а также в совместно переуступленных заявках 08/379072, 08/487550 или 08/746361, которые все включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Сообщалось, что указанные антитела проявляют высокую степень гомологии с антителами человека, т.е. 85-98%, проявляют эффекторные функции антител человека, обладают пониженной иммуногенностью и могут проявлять высокую аффинность по отношению к антигенам человека.

Под «фрагментом антитела» понимается такой фрагмент антитела, как Fab, F(ab )2, Fab и scFv.

Под «химерным антителом» подразумевается антитело, содержащее последовательности, полученные из двух разных антител, которые обычно являются антителами разных видов. Чаще всего химерные антитела содержат фрагменты антител человека и мыши и в большинстве случаев константные области человека и вариабельные области мыши.

Под «биспецифичным антителом» подразумевается молекула антитела с одним антигенсвязывающим сайтом, специфичным для одного антигена, и другим антигенсвязывающим сайтом, специфичным для другого антигена.

Под «иммуногенностыо» подразумевается способность направленного к мишени белка или терапевтического компонента вызывать иммунный ответ (например, гуморальный или клеточный) при введении субъекту.

Особенно предпочтительным является приготовление парентеральных композиций в виде дозированной лекарственной формы для простоты введения и единообразного дозирования. «Дозированная лекарственная форма» в используемом в данном описании смысле относится к физически дискретным единицам, подходящим для однократных доз для субъектов-млекопитающих, которых необходимо лечить; при этом рассчитывают каждую единицу, содержащую предварительно определенное количество активного соединения, чтобы получить требуемый терапевтический эффект, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Конкретное определение дозированных лекарственных форм согласно изобретению продиктовано и непосредственно зависит от (А) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического действия, которое необходимо достичь; и (В) ограничений, неизбежных в области составления рецептуры такого активного соединения для лечения, связанных с чувствительностью индивидуумов.

В. Антагонисты CD40L.

Согласно способам изобретения антагонист CD40L вводят субъекту для того, чтобы воспрепятствовать взаимодействию CD40L и его партнера при связывании, CD40. «Антагонист CD40L» определяют как молекулу, которая препятствует такому взаимодействию. Антагонистом CD40L может быть антитело, направленное против CD40L (например, моноклональное антитело против CD40L), фрагмент или производное антитела против CD40L (например, Fab или F(ab) 2-фрагменты), химерные антитела или гуманиэированные антитела, растворимые формы CD40, растворимые формы слитого белка, содержащего CD40, или фармацевтические средства, которые разрушают или препятствуют взаимодействию CD40L-CD40 или препятствуют передаче сигнала через CD40.

Антитела. Чтобы получить анти-CD40L-антитела млекопитающего (например, мышь, хомячок, кролик или копытное животное), можно иммунизировать иммуногенной формой белка или белкового фрагмента CD40L (например, пептидного фрагмента), которая вызывает гуморальный ответ у животного. В качестве иммуногена также можно использовать клетку, экспрессирующую CD40L на своей поверхности. Альтернативные иммуногены включают в себя очищенный белок CD40L или очищенные белковые фрагменты. CD40L можно очищать из клетки, экспрессирующей CD40L, стандартными способами очистки (Armitage et al. (1992); Lederman et al. (1992); и Hollenbaugh et al. (1992)). Альтернативно пептиды CD40L можно получить на основе аминокислотной последовательности CD40L, как показано у Armitage et al. (1992). Способы придания иммуногенности белку включают в себя конъюгацию с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области. Например, белок можно вводить в присутствии адъюванта. Процесс иммунизации можно контролировать путем определения титра антител в плазме или сыворотке. Можно использовать стандартный метод ELISA или другой иммуноаналиэ с иммуногеном в качестве антигена, чтобы оценить уровни антител. После иммунизации можно получить антисыворотку и выделить поликлональные антитела. Чтобы получить моноклональные антитела, можно собрать антителопродуцирующие клетки и слить с клетками миеломы, используя стандартные способы слияния соматических клеток, как описано в патентах США № 5833987 (1998) и 5747037 (1997).

Антитела можно фрагментировать, используя стандартные способы, и можно провести скрининг фрагментов в отношении применимости таким же образом, который описан выше для целых антител. Например, F(ab') 2-фрагменты можно создать при обработке антител пепсином. Полученный в результате F(ab')2-фрагмент можно обработать, чтобы восстановить дисульфидные мостики и получить Fab'-фрагменты. Другие рассматриваемые фрагменты антител включают в себя Fab и scFv.

Один из способов минимизации распознавания антител нечеловека при терапевтическом использовании на людях, отличный от общей иммуносупрессии, заключается в получении химерных производных антител, т.е. молекул антител, в которых объединены вариабельная область антитела не человека, а животного, и константная область антитела человека. Молекулы гуманизированных химерных антител, например, могут содержать антигенсвязывающий домен из антитела мыши, крысы или другого вида, и константные области антитела человека. Способы получения указанных гуманизированных химерных антител включают в себя способы, описанные в ссылках, цитируемых в патенте США № 5833987 (1998).

В целях терапии человека антитела, специфично реагирующие с белком или пептидом CD40L, можно далее гуманизировать благодаря получению химер вариабельных областей антитела человека, в которых части вариабельных областей, особенно консервативные каркасные районы антигенсвязывающего домена, имеют человеческое происхождение, и только гипервариабельные районы не имеют человеческого происхождения. Такие измененные молекулы иммуноглобулина можно получить любым из нескольких способов, известных в данной области (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4: 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol. 92: 3-16 (1982)), и предпочтительно получают в соответствии со способами опубликованной заявки РСТ WO 92/06193 или ЕР 0239400. Гуманизированные антитела можно получить коммерческим способом, например, Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain. Предпочтительное гуманизированное gp 39(CD40L)-антитело, IDEC-131, описано в согласованной заявке на выдачу патента США 08/554840, включенной в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

Другим способом создания специфичных антител или фрагментов антител, реагирующих против белка или пептида CD40L (например, такого как слитый белок gp 39, описанный в патенте США № 5945513), является скрининг экспрессирующих библиотек, кодирующих гены иммуноглобулинов, или их части, экспрессируемые в бактериях, с помощью белка или полипептида CD40L. Например, полные Fab-фрагменты, VH-районы и Fv-районы можно экспрессировать в бактериях, используя экспрессирующие фаговые библиотеки. См., например. Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); и McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Посредством скрининга таких библиотек, например с помощью пептида CD40L, можно идентифицировать фрагменты иммуноглобулинов, реагирующие с CD40L. Альтернативно можно использовать мышей SCID-hu (доступные из Genpharm), чтобы получить антитела или их фрагменты.

Методики получения моноклональных антител (МАт), направленных против CD40L, включая CD40L человека и CD40L мыши, и подходящие антитела для применения в способах согласно изобретению описаны в заявке на выдачу патента РСТ № WO 95/06666, озаглавленной «Anti-gp 39 Antibodies and Uses Therefor»; руководства которой включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Особенно предпочтительными антителами против CD40L человека согласно изобретению являются МАт 24-31 и 89-76, полученные соответственно с помощью гибридом 24-31 и 89-76. Гибридомы 89-76 и 24-31, продуцирующие соответственно антитела 89-76 и 24-31, были депонированы по условиям Будапештского договора в американской коллекции типов культур (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, 2 сентября, 1994 г. Гибридоме 89-76 присвоили инвентарный номер АТСС НВ11713, и гибридоме 24-31 присвоили инвентарный номер АТСС НВ11712.

Рекомбинантные анти-CD40L-антитела, такие как химерные и гуманизированные антитела, можно получить посредством обработки нуклеиновой кислоты (например, ДНК или кДНК), кодирующей анти-CD40L-антитела, в соответствии со стандартными способами рекомбинантной ДНК. Таким образом, другой аспект данного изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелые или легкие цепи иммуноглобулинов или их части, реагирующие с CD40L, в частности CD40L человека. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, может кодировать вариабельную область легкой (VL) или тяжелой (VН) цепи иммуноглобулина вместе или без связанной константной области тяжелой или легкой цепи (или ее части). Такие нуклеиновые кислоты можно выделить из клетки (например, гибридомы), продуцирующей МАт против CD40L человека, стандартными способами. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие МАт 24-31 или 89-76, можно выделить соответственно из гибридом 24-31 или 89-76, путем скрининга библиотеки кДНК, ПЦР-амплификации или другими стандартными способами. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие МАт против CD40L человека, можно включить в экспрессирующий вектор и ввести в подходящую клетку-хозяина, чтобы обеспечить экспрессию и продукцию рекомбинантных форм антител против CD40L человека.

Приматизированные антитела. Другие высокоэффективные способы создания рекомбинантных антител представлены Newnan, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992). Более конкретно, результатом указанного способа является создание приматизированных антител, которые содержат вариабельные домены обезьян и константные последовательности человека. Данная публикация включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Кроме того, указанный способ также описан в совместно переуступленной заявке на выдачу патента США № 08/379072, поданной 25 января 1995 г., которая является продолжением заявки на выдачу патента США с регистрационным № 07/912292, поданной 10 июля 1992 г., которая является частичным продолжением заявки на выдачу патента США с регистрационным № 07/856281, поданной 23 марта 1992 г., которая, наконец, является частичным продолжением заявки на патент США с регистрационным № 07/735064, поданной 25 июля 1991. Заявка 08/379072 и все исходные заявки включены в данное описание в качестве ссылок в полном объеме.

Указанным способом модифицируют антитела так, что они не отторгаются из-за своих антигенных свойств при введении людям. Указанный способ основан на иммунизации макак-крабоедов антигенами или рецепторами человека. Данный способ был разработан для того, чтобы создать моноклональные антитела высокой аффинности, направленные к поверхностным антигенам клеток человека.

Идентификацию антител макак к CD40L человека путем скрининга библиотек на основе фагового дисплея или гетерогибридом обезьян, полученных с использованием В-лимфоцитов обезьян, иммунизированных CD40L, можно осуществить с использованием способов, описанных в совместно переуступленной заявке на патент США № 08/487550, поданной 7 июня 1995 г, включенной в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

Ранее сообщалось, что антитела, полученные с использованием способов, описанных в указанных заявках, проявляют эффекторную функцию антитела человека, обладают пониженной иммуногенностыо и продолжительным временем полужизни в сыворотке. Технология основана на том, что, несмотря на тот факт, что макаки-крабоеды филогенетически сходны с людьми, они все же распознают многие белки человека как чужеродные и поэтому вырабатывают иммунный ответ. Кроме того, поскольку макаки-крабоеды филогенетически близки людям, было обнаружено, что антитела, выработанные у этих обезьян, обладают высокой степенью аминокислотной гомологии с антителами, полученными у людей. Действительно, после секвенирования генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина макак было обнаружено, что последовательность каждого семейства генов на 85-98% гомологична последовательности эквивалента человека (Newman et al., 1992). Первое созданное таким образом антитело, анти-СВ4-антитело, было на 91-92% гомологично консенсусной последовательности каркасных районов иммуноглобулина человека (Newman et al., 1992).

Как описано выше, данное изобретение частично относится к идентификации моноклональных антител или их приматизированных форм, которые специфичны по отношению к антигену CD40L человека и способны ингибировать передачу сигнала через CD40 или ингибировать взаимодействие CD40/CD40L. Блокирование сайта первичной активации между CD40 и CD40L идентифицированным антителом (или его терапевтически эффективным фрагментом), обеспечивая возможность комбинированного антагонистического действия на позитивную костимуляцию с агностическим действием на негативную передачу сигнала, будет пригодным терапевтическим подходом воздействия на рецидивирующие формы злокачественной опухоли, особенно на В-клеточные лимфомы и лейкозы. Функциональную активность идентифицированных антител определяют по блокированию сигналов CD40, позволяющих клетке выживать и избегать апоптоза, индуцированного IgM или Fas.

Производство новых моноклональных антител обезьян, которые специфично связывают CD40L или CD40 человека, а также полученных из них приматизированных антител, можно осуществлять с использованием способов, описанных в заявке на выдачу патента США, поданной для совместного рассмотрения, с регистрационным № 08/487550, и как здесь указано. Данные антитела обладают высокой аффинностью к CD40L и поэтому их можно использовать в качестве иммуносупрессоров, которые ингибируют путь CD40L/CD40.

Получение моноклональных антител обезьян предпочтительно будет осуществлено путем скрининга библиотек на основе фагового дисплея или за счет получения гетерогибридом обезьян с использованием В-лимфоцитов, полученных от обезьян, иммунизированных CD40L (например, CD40 человека). CD40 человека также может быть из слитого белка, описанного в патенте США № 5945513.

Как указано, первый способ создания анти-CD40L-антител заключается в технологии рекомбинантного фагового дисплея. Данный способ в общих чертах описан выше.

По существу способ будет включать в себя синтез рекомбинантных библиотек иммуноглобулинов против антигена CD40L, экспонированных на поверхности нитчатого фага, и селекцию фагов, которые секретируют антитела, обладающие высоким сродством к антигену CD40L. Как отмечено выше, предпочтительно будут отбираться антитела, которые связываются как с CD40L, так и с CD40 человека. Для осуществления такой методологии авторы данного изобретения, чтобы получить библиотеки обезьян, создали уникальную библиотеку, в которой уменьшена возможность рекомбинации и повышена стабильность.

По существу, чтобы принять на вооружение фаговый дисплей для применения в случае библиотек обезьян, данный вектор содержит специфичные праймеры для ПЦР-амплификации генов иммуноглобулинов обезьян. Указанные праймеры основаны на последовательностях макак, полученных при разработке технологии приматизации, и баз данных, содержащих последовательности человека.

Подходящие праймеры представлены в совместно переуступленной заявке 08/379072, включенной в данное описание в качестве ссылки.

Второй способ заключается в иммунизации обезьян, например макак, направленной против антигена CD40L человека. Преимущества, присущие макакам, связанные с получением моноклональных антител, обсуждаются выше. В частности таких обезьян, например макак-крабоедов, можно иммунизировать против антигенов или рецепторов человека. Кроме того, полученные в результате антитела можно использовать для создания приматизированных антител согласно способу Newman et al. (1992) и Newman et al., совместно переуступленной заявке на выдачу патента США с регистрационным номером № 08/379072, поданной 25 января 1995 г., и указанные работы включены в данное описание в качестве ссылок в полном объеме.

Существенное преимущество антител, полученных от макак-крабоедов, состоит в том, что обезьяны распознают многие белки человека как чужеродные и поэтому обеспечивают образование антител, некоторые из которых обладают высоким сродством к требуемым антигенам человека, например поверхностным белкам и клеточным рецепторам человека. Кроме того, поскольку они филогенетически близки людям, полученные в результате антитела проявляют высокую степень аминокислотной гомологии с антителами, полученными у человека. Как отмечено выше, после секвенирования генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина макак было обнаружено, что каждое семейство генов было на 85-88% гомологично их аналогам у человека (Newman et al., 1992).

По существу, макакам-крабоедам вводят антиген CD40L человека, из них выделяют В-клетки, например у животных берут биопсии лимфатического узла, и затем В-лимфоциты сливают с клетками гетеромиеломы КН6/В5 (мышь × человек), используя полиэтиленгликоль (ПЭГ). Затем идентифицируют гетерогибридомы, секретирующие антитела, которые связывают антиген CD40L человека.

Желательны антитела, которые связываются с CD40L или CD40 таким образом, который прекращает или регулирует передачу сигнала через CD40, поскольку такие антитела потенциально можно использовать для того, чтобы ингибировать взаимодействие CD40L с CD40, с их встречными рецепторами. Если можно выработать антитела против более чем одного эпитопа на CD40L или CD40 и использовать антитела вместе, их комбинированная активность потенциально может давать синергическое действие.

Заявляемое изобретение заключается в применении к животному, которое примировано к продукции конкретного антитела (например, приматы, такие как орангутанги, бабуины, макаки и макаки-крабоеды). Другие животные, которых можно использовать для выработки антител к CD40L человека, включают в себя, но не ограничиваясь этим, следующих животных: мышей, крыс, морских свинок, хомячков, обезьян, свиней, коз и кроликов.

Предпочтительный способ получения антител человека с использованием мышей SCID раскрыт в находящейся в совместном владении, поданной для совместного рассмотрения заявке на выдачу патента США с регистрационным № 08/488376.

Гены человека, кодирующие антигены CD40, CD40L и CD20, клонированы и секвенированы, и поэтому их можно легко получить рекомбинантными способами.

Предпочтительно антигены CD40L, CD40 или CD20 человека следует вводить в растворимой форме, например, в результате экспрессии гена, кодирующего антиген, у которого удалены трансмембранный и цитоплазматический домены, и при этом оставлена только внеклеточная часть, т.е. внеклеточные домены, подобные суперсемейству V и С.

Макак иммунизируют антигеном CD40L, предпочтительно его растворимой формой, в условиях, которые приводят к продукции специфичных для него антител. Предпочтительно растворимый антиген CD40L человека следует вводить в комбинации с адьювантом, например полным адъювантом Фрейнда (CFA), квасцами, сапонином или другими известными адъювантами, а также с их комбинациями. Как правило, потребуется повторная иммунизация, например, путем повторных инъекций в течение нескольких месяцев. Например, введение растворимого антигена CD40L человека осуществляют в адъюванте с бустер-иммунизациями в течение периода времени от 3 до 4 месяцев, получая в результате сыворотку, содержащую антитела, которые связывают антиген CD40L человека.

После иммунизации собирают В-клетки, например, посредством взятия биопсий лимфатических узлов у иммунизированных животных, и В-лимфоциты сливают с клетками гетеромиеломы КН6/В5 (мышь × человек), используя полиэтиленгликоль. Способы получения таких гетеромиелом известны, и их можно найти в заявке на выдачу патента США с регистрационным № 08/379072, Newman et al., поданной 25 января 1995 г. и включенной в данное описание в качестве ссылки.

Затем идентифицируют гетерогибридомы, которые секретируют антитела, которые связывают CD40L человека. Это можно осуществить методом ELISA или радиоиммуноанализа с помощью антигена CD40L человека, меченного ферментом или радионуклидом.

Затем линии клеток, которые секретируют антитела, обладающие требуемой специфичностью по отношению к антигену CD40L человека, субклонируют до моноклональности.

Линии клеток, которые экспрессируют антитела, которые специфично связываются с антигеном CD40L человека, затем используют для того, чтобы клонировать последовательности вариабельных доменов для получения приматизированных антител, в основном, как описано у Newman et al., (1992) и Newman et al., патент США с регистрационным № 379072, поданный 25 января 1995 г., обе работы включены в данное описание в качестве ссылки. По существу это связано с экстракцией РНК из клеток превращением ее в кДНК и амплификацией кДНК посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для Ig. Подходящие праймеры описаны у Newman et al., 1992 и в патенте США с регистрационным №379072.

Клонированные вариабельные гены обезьян затем встраивают в экспрессирующий вектор, который содержит гены константных областей тяжелой и легкой цепей человека. Предпочтительно это осуществляют, используя запатентованный экспрессирующий вектор IDEC, Inc., названный NEOSPLA. Указанный вектор содержит промотор/энхансер цитомегаловируса, главный промотор бета-глобина мыши, начало репликации SV40, последовательность полиаденилирования гормона роста быка, экзон 1 и экзон 2 неомицинфосфотрансферазы, константную область иммуноглобулина человека каппа- или лямбда-типа, ген дигидрофолатредуктазы, константную область РЕ иммуноглобулина человека гамма 1 или гамма 4 и последовательность лидера. Обнаружено, что данный вектор приводит к высокой экспрессии приматизированных антител при включении генов вариабельных областей обезьян, трансфекции в клетки СНО и последующей селекции в среде, содержащей G418, и амплификации в присутствии метотрексата.

Например, ранее заявлена указанная система экспрессии, для того, чтобы в результате получить приматизированные антитела, обладающие высокой авидностью (Kd 10-10 М) по отношению к CD4 и другим поверхностным рецепторам клеток человека. Кроме того, обнаружено, что антитела проявляют такую же аффинность, специфичность и функциональную активность, как и исходные антитела обезьян. Указанная векторная система в значительной степени раскрыта в совместно переуступленном патенте США с регистрационным №379072, включенном в данное описание в качестве ссылки, а также в заявке на выдачу патента США с регистрационным №08/149099, поданной 3 ноября 1993 г, также включенной в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Данная система обеспечивает высокие уровни экспрессии, т.е. > 30 пг/клетка/сутки.

Количество антитела, подходящее для получения терапевтического эффекта, можно определить стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области. Антитела в основном будут приготовлены стандартным способом с фармацевтически приемлемым буфером, и их можно вводить любым желательным путем. Благодаря эффективности заявляемых антител и толерантности к ним человека указанные антитела можно вводить повторно для борьбы с разными заболеваниями или патологическими состояниями у человека.

Специалист в данной области сможет путем обычного экспериментирования определить, каким должно быть в целях индуцирования иммуносупрессии эффективное нетоксичное количество антитела. Однако, как правило, эффективная доза будет в пределах примерно от 0,05 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела в сутки.

Антитела (или их фрагменты) согласно данному изобретению должны быть также пригодны для лечения опухолей млекопитающих. Более конкретно, они должны быть пригодны для уменьшения размера опухоли, ингибирования роста опухоли и/или пролонгирования времени выживания животных, несущих опухоль. Соответственно, данное изобретение также относится к способу лечения опухолей у человека или другого животного путем введения такому человеку или животному эффективного нетоксичного количества антитела. Специалист в данной области сможет путем обычного экспериментирования определить, каким должно быть в целях лечения канцерогенных опухолей эффективное нетоксичное количество анти-CD40L-антитела. Однако, как правило, предполагается, что эффективная доза будет заключена в пределах примерно от 0,05 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела в сутки.

Антитела согласно изобретению можно вводить человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для того, чтобы произвести такое действие на терапевтическом или профилактическом уровне. Такие антитела согласно изобретению можно вводить указанному человеку или другому животному в обычной дозированной форме, приготовленной путем комбинирования антитела согласно изобретению с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными способами. Специалисту в данной области будет очевидно, что форма и природа фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя диктуется количеством активного ингредиента, с которым его необходимо комбинировать, путем введения и другими хорошо известными переменными.

Путь введения антитела (или его фрагмента) согласно изобретению может быть пероральным, парентеральным, посредством ингаляции или локальным. Термин парентеральный в используемом здесь смысле включает в себя внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное ведение. Как правило, предпочтительны подкожная и внутримышечная формы парентерального введения.

Ежедневные режимы дозирования при парентеральном и пероральном введении для используемых соединений согласно изобретению, для того чтобы профилактически или терапевтически индуцировать иммуносупрессию, или для того, чтобы лечить канцерогенные опухоли, как правило, будут заключены в пределах примерно от 0,05 до 100, но предпочтительно примерно от 0,5 до 10 миллиграмм на килограмм массы тела в сутки.

Антитела согласно изобретению также можно вводить посредством ингаляции. Под «ингаляцией» понимают интраназальное или пероральное ингаляционное введение. Соответствующие дозированные формы для такого введения, такие как аэрозольная композиция или дозирующий ингалятор, можно получить стандартными способами. Предпочтительное дозовое количество используемого соединения согласно изобретению, как правило, находится в пределах примерно от 10 до 100 миллиграмм.

Антитела согласно изобретению также можно вводить локально. Под локальным введением подразумевается несистемное введение, и оно включает в себя применение соединения антитела (или его фрагмента) согласно изобретению наружно на эпидермис, в буккальную полость и закапывание такого антитела в ухо, глаз и нос, и там, где антитело не проникает в значительной степени в поток крови. Под системным введением понимается пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное и внутримышечное введение. Количество антитела, необходимое для терапевтического или профилактического действия, конечно, будет варьировать в зависимости от выбранного антитела, природы и тяжести состояния, которое лечат, и животного, которое подвергается обработке, и, в конечном счете, находится на усмотрении врача. Подходящая локальная доза антитела согласно изобретению будет заключаться, как правило, в пределах примерно от 1 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела ежедневно.

С. Растворимые лиганды CD40L.

В дополнение к антителам, которые распознают и связываются с CD40L и ингибируют его взаимодействие с CD40, предусматривают применение других антагонистов CD40L для лечения В-клеточных лимфом и лейкозов либо отдельно, либо в комбинации с другими способами терапии (например, лучевой или химиотерапией). Другие антагонисты CD40L представляют собой растворимые формы лиганда CD40L. Моновалентный растворимый лиганд CD40L, такой как растворимый CD40, может связывать CD40L, тем самым ингибируя взаимодействие CD40L с CD40, экспрессированным В-клетками. Термин «растворимый» показывает, что лиганд не постоянно связан с мембраной клетки. Растворимый лиганд CD40L можно получить путем химического синтеза или предпочтительно способами рекомбинантной ДНК, например, посредством экспрессии только внеклеточного домена (при отсутствии трансмембранного и цитоплазматического доменов) лиганда. Предпочтительным растворимым лигандом CD40L является растворимый CD40. Альтернативно растворимый лиганд CD40L может быть в форме слитого белка. Такой слитый белок содержит по меньшей мере часть лиганда CD40L, связанную со второй молекулой. Например, CD40 можно экспрессировать в виде слитого белка с иммуноглобулином (т.е. CD40 Ig-слитый белок). В одном варианте получают слитый белок, содержащий аминокислотные остатки части молекулы CD40, соответствующей внеклеточному домену, соединенные с аминокислотными остатками последовательности, соответствующей шарнирному участку, районам СН2 и СН3, тяжелой цепи иммуноглобулина, например, C 1, чтобы образовать слитый белок CD40Ig (см., например, Linsley et al., J. Exp. Med. 1783: 721-730 (1991); Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989) и патент США №5116964 (1992)). Такие слитые белки можно получить путем химического синтеза или предпочтительно способами рекомбинантной ДНК на основе кДНК CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403-10 (1989)).

D. Введение анти-CD40L.

Антагонист CD40L вводят субъекту в биологически совместимой форме, подходящей для фармацевтического введения in vivo. Под «биологически совместимой формой, подходящей для введения in vivo» понимается форма антагониста, который необходимо ввести, для которого терапевтическое действие белка превосходит любые токсические эффекты. Подразумевается, что термин «субъект», используемый в описании, включает в себя живые организмы, в которых можно вызвать иммунный ответ, например, млекопитающие. Примеры предпочтительных субъектов включают в себя людей, собак, кошек, лошадей, копытных животных, коров, свиней, коз, овец, мышей, крыс и их трансгенные виды. Антагонист CD40L можно вводить в любой фармакологической форме, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. Введение терапевтически эффективного количества антагониста определяют как количество, эффективное при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата (например, ингибирования прогрессии или пролиферации лимфомы, которая подвергается лечению). Например, терапевтически активное количество антагониста CD40L может варьировать в соответствии с такими факторами, как стадия болезни (например, стадия I по сравнению со стадией IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, лимфомы связанные или возникшие в результате СПИД или других иммуносупрессивных состояний или заболеваний) и массы субъекта, и способности антагониста вызывать желаемый ответ у субъекта. Режим дозирования можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ. Например, ежедневно можно вводить несколько дробных доз, или доза может быть пропорционально снижена согласно требованиям терапевтической ситуации.

Активное соединение, такое как анти-CD40L-антитело, само по себе или в комбинации с другими активными агентами, можно вводить удобным способом, таким как инъекция (подкожная, внутримышечная, внутривенная и т.д.), пероральное введение ингаляция, трансдермальное применение или ректальное введение. В зависимости от пути введения активное соединение может быть покрыто материалом, чтобы защитить соединения от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Предпочтительным путем введения является внутривенная (в/в) инъекция.

Для того чтобы ввести антагонист CD40L другим способом, отличным от парентерального введения, может быть необходимым покрытие антагониста или совместное введение антагониста с материалом, предотвращающим инактивацию. Например, антагонист можно вводить индивидууму в соответствующем носителе или разбавителе, совместно вводить с ингибиторами ферментов или в соответствующем носителе или векторе, таком как липосома. Фармацевтически приемлемые разбавители включают в себя физиологический раствор и водные буферные растворы. Ингибиторы ферментов включают в себя ингибитор трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфат (DEP) и тразилол. Липосомы включают в себя эмульсии типа вода-масло-вода, а также традиционные липосомы (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27-41 (1984)). Дополнительные фармацевтически приемлемые носители и наполнители известны в данной области.

Активное соединение также можно вводить парентерально или внутрибрюшинно. Также можно приготовить дисперсии в глицерине, жидких политиленгликолях и их смесях или маслах. При обычных условиях хранения и применения указанные препараты могут содержать консервант, чтобы предотвратить рост микроорганизмов.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы (в случае водорастворимых соединений) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления непосредственно перед использованием стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей в такой степени, при которой она легко проходит через шприц. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть предохранена от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, высокомолекулярный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящими смесями. Подходящую текучесть можно, например, поддерживать благодаря использованию покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и при использовании поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно добиться различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например парабенами, хлорбутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой, тимерозалом и тому подобное. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композиции изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированную абсорбцию инъекционных композиций можно вызвать включением в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно приготовить включением активного соединения (например, антагониста CD40L как такового или в комбинации с другими активными средствами) в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости с одним ингредиентом или их комбинацией, перечисленных в данном описании, с последующей фильтрационной стерилизацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительные способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и лиофильную сушку, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент, из их предварительно стерильно профильтрованного раствора.

В том случае, если активное соединение соответствующим образом защищено, как описано выше, белок можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усвояемым съедобным носителем. В используемом здесь смысле «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любой и все растворители, дисперсионные среду, покрывающие материалы, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотоничные и замедляющие абсорбцию средства и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Кроме случаев, при которых какие-либо обычные среды или агенты несовместимы с активным соединением, их применение предполагается в терапевтических композициях. Все обсуждаемые выше композиции для применения с антагонистами CD40L также могут содержать в композиции дополнительные активные соединения (например, химиотерапевтические средства, анти-CD20-антитела).

Е. Введение анти-CD40L с другими средствами.

Болезнь Ходжкиха. Примерно 7500 новых случаев болезни Ходжкина (БХ) диагностируются ежегодно в Соединенных Штатах. Использовали отдельно лучевую терапию для лечения БХ в стадии I, II и даже в стадии III. Также использовали радиацию в комбинации с химиотерапией (например, ABVD и МОРР). См. V.Т.DeVita et al., "Hodgkin s Disease," IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, vol.2, 2142-2283 (DeVita et al., eds., 5 th ed. 1997) и ссылки в данной работе в связи с введением радиации и протоколами химиотерапии при лечении БХ.

Лекарственные средства для химиотерапии, пригодные для лечения БХ, включают в себя алкилирующие агенты, алкалоиды Vinca (например, винкристин и винбластин), прокарбазин, метотрексат и преднизон. Комбинация четырех лекарственных средств МОРР (мехлоретамин (азотный иприт), винкристин (онковин), прокарбазин и преднизон) является очень эффективной при лечении БХ. Для пациентов, резистентных к МОРР, можно использовать комбинации ABVD (например, адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин), ChlVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин и преднизон), CABS (ломустин, доксорубицин, блеомицин и стрептозотоцин), МОРР плюс ABVD, MOPP плюс ABV (доксорубицин, блеомицин и винбластин) или BCVPP (кармустин, циклофосфамид, винбластин, прокарбазин и преднизон). Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) и V.Т.DeVita et al., (1997) и ссылки, цитированные в данных работах в связи со стандартным дозированием и схемами приема. Указанные способы терапии можно использовать без изменения или при необходимости изменять для конкретного пациента, в комбинации с антагонистами CD40L как таковыми, или еще в комбинации с анти-CD20-антителами или их фрагментами.

Для рецидивирующей или резистентной БХ можно обычные комбинированные дозовые режимы «терапии спасения» использовать в комбинации в анти-CD40L-антителами, отдельно или вместе с анти-CD20-антителами. Примеры обычных комбинированных дозовых режимов «терапии спасения» при БХ включают в себя VABCD (винбластин, доксорубицин, дакарбазин, ломустин и блеомицин), ABDIC (доксорубицин, блеомицин, дакарбазин, ломустин, преднизон), CBVD (ломустин, блеомицин, винбластин и дексаметазон), PCVP (винбластин, прокарбазин, циклофосфамид и преднизон), СЕР (ломустин, этопозид и преднимустин), EVA (этопоэид, винбластин и доксорубицин), MOPLACE (циклофосфамид, этопозид, преднизон, метотрексат, цитарабин и винкристин), MIME (метил-GAG, ифосфамид, метотрексат и этопозид), MINE (митоквазон, ифосфамид, винорелбин и этопозид), МТХ-СНОР (метотрексат и CHOP), СЕМ (ломустин, этопозид и метотрексат), CAVP (ломустин, мелфалан, этопозид и преднизон), EVAP (этопозид, винбластин, цитарабин и цисплатин), EPOCH (этопозид, винкристин, доксорубицин, циклофосфамид и преднизон) с использованием доз и схем приема, которые описаны в V. Т. DeVita et al., (1997).

Неходжкинсхая лимфома (ВХЛ). Примерно 40000 новых случаев НХЛ ежегодно диагностируется в США, и, по-видимому, это количество увеличивается. Более того, НХЛ занимает четвертое место по общему количеству людей, умирающих ежегодно от рака. НХЛ включает в себя несколько подтипов лимфом с уникальным клиническим проявлением и естественным ходом развития. Классификация подтипов НХЛ изложена по общепринятой классификации НХЛ, рабочей классификации. В таблице 1 представлены три степени рабочей классификации.

Таблица 1 
Степень злокачественности Подтип НХЛ 
Низкая степень Мелкоклеточная лимфоцитарная

Фолликулярная, преимущественно из 

мелких клеток с расщепленными ядрами

Фолликулярная из смеси мелких клеток с

расщепленными ядрами и крупных клеток 
Промежуточная степень Фолликулярная, преимущественно из крупных клеток

Диффузная из мелких клеток с расщепленными ядрами

Диффузная из смеси мелких и крупных клеток

Диффузная крупноклеточная 
Высокая степень Крупноклеточная иммунобластная

Лимфобластная

Из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта 
Другие типы Лимфомы, связанные со СПИДом

Кожные Т-клеточные лимфомы

Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых

Ангиоиммунобластная лимфаденопатия

Моноцитоидная В-клеточная лимфома 


В-клеточные типы НХЛ включают в себя: мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (SLL/B-CLL), лимфоплазмоцитоидную лимфому (LPL), лимфому мантийных клеток (MCL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную лимфому из крупных клеток (DLCL) и лимфому Беркитта (BL). См. Gaidano et al., "Lymphomas," IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5 th ed. 1997). Две другие классификации (например, Кильская классификация и пересмотренная Евро-Американская классификация лимфом, или REAL) также используются в онкологии, и названия НХЛ могут меняться в двух системах классификации. См. М. A. Shipp et al., "Non Hodgkin's Lymphomas, "IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY vol. 2. 2165-2220 (DeVita et al., eds., 5th ed. 1997). НХЛ-лимфомы, кроме того, можно классифицировать по возрасту пациента, у которого она диагностирована:

Таблица 2 
В-клеточные лимфомы взрослых В-клеточные лимфомы детского возраста. 
Фолликулярная лимфома Диффузная В-клеточная лимфома из крупных клеток Лимфома из мантийных клеток B-CLL/SLL Лимфома Беркитта

Диффузная В-клеточная лимфома из крупных клеток

Фолликулярная лимфома

Лимфома из предшественников В-

LBL 
Иммуноцитома/Вальденстрема 
Тип MALT/моноцитоидная В-клеточная 


См. М.A. Shipp et al., (1997).

Лучевая терапия обычно ограничена лечением пациентов, у которых диагностирована I или II стадия НХЛ низкой степени злокачественности, и как возможное целебное средство для пациентов, у которых агрессивно развиваются стадии болезни. Данное изобретение охватывает комбинирование антагониста CD40L с лучевой терапией, а также другими способами лечения рака для лечения НХЛ.

Химиотерапию используют для большинства пациентов с II стадией и для всех пациентов с III и IV стадиями болезни. Режимы включают в себя применение отдельных алкилирующих агентов, таких как циклофосфамид или хлорамбуцил, или комбинаций, таких как CVP (циклофосфамид, винкристии и преднизон), CHOP (CVP и доксорубицин), С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбаэин), CAP-BOP (CHOP плюс прокарбазин и блеомицин), m-BACOD (CHOP плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин), РгоМАСЕ-МОРР (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандарт МОРР), ProMACE-CytaBOM (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкристин, метотрексат и лейковорин) и МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, фиксированная доза преднизона, блеомицин и лейковорин). См. Shipp et al. (1997) для выяснения стандартных доз и схемы приема. CHOP также комбинировали с блеомицином, метотрексатом, прокарбазином, азотным ипритом, цитозинарабинозидом и этопозидом. Менее широко используемые лекарственные средства для лечения НХЛ включают в себя: 2-хлордезоксиаденозин (2-CDA), 2'-дезоксикоформицин и флударабин. Для пациентов с НХЛ промежуточной и высокой степени, у которых не удается достичь ремиссии или которые переживают рецидив, используют терапию «спасения». При терапии «спасения» применяют такие лекарственные средства, как цитозинарабинозид, цисплатин, этопозид и ифосфамид, которые даются отдельно или в комбинации. Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788. В случаях рецидивирующих агрессивных форм НХЛ рекомендованы следующие протоколы IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид), MIME (метил-gag, ифосфамид, метотрексат и этопозид), DHAP (дексаметазон, высокая доза цитарабина и цисплатина), ESHAP (этопозид, метилпредизолон, HD-цитарабин, цисплатин), СЕРР(В) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин) и CAMP (ломустин, митоксантрон, цитарабин и. преднизон) с использованием дозирования и схем применения, описанных в Shipp et al., (1997).

Рекомендованы следующие протоколы для НХЛ детского возраста на основе гистологии и стадии:

Таблица 3 
Гистология Протокол 
Лимфобластная 
Стадия 1 CHOP 
Стадия 2 СОМР 
Стадия 3 АРО 
Стадия 4 LSA2L 2, NHL-BFM 86 
Лимфома из мелких клеток с

нерасщепленными ядрами или

лимфома Беркитта

Стадия 1

Стадия 2

Стадия 3 

CHOP 
СОМР 
NHL-BFM 86, St. Jude Total В, 
LMB 89 
Стадия 4/B-ALL LMB89 
Крупноклеточная 
Стадия 1 CHOP 
Стадия 2 СОМР 
Стадия 3 APO 
Стадия 4 NHL-BFM 86, АСОР 


APO = доксорубицин, преднизон и винкристин; СОМР = циклофосфамид, онковин, метотрексат и преднизон. См. Н.J.Weinstein et al., «Leukemias and Lymphomas of Childhood,» IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, vol.2, 2145-2165 (DeVita et al., eds., 5 th ed. 1997) и цитированные в указанной работе ссылках, все работы включены в данное описание в качестве ссылки.

Анти-CD40L-антитела и антагонисты можно использовать в комбинации с любыми химиотерапевтическими средствами и/или лучевой терапией, используемыми в настоящее время для лечения БХ или диагностированных подтипов НХЛ. Анти-CD20-антитела также можно добавлять в смесь используемых терапевтических средств. Количество химиотерапевтического средства, используемого в комбинации с анти-CD40L-антителами или антагонистами CD40L, может меняться субъектом или может быть введено в соответствии с тем, что известно в данной области. См., например, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN AND GILMAN S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996).

Лейкозы и другие злокачественные опухоли.

Рассматриваемая терапия и способы лечения согласно настоящему изобретению также можно использовать для лечения В-клеточных лейкозов, включая ALL-L3 (лейкоз типа Беркитта) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), а также моноцитарный лейкоз и другие злокачественные опухоли, которые экспрессируют CD40.

Лечение ALL включает в себя применение винкристина и преднизона. При таком лечении также можно добавлять антрациклин, циклофосфамид, L-аспарагиназу. Другие способы индукционной терапии включают в себя комбинации четырех лекарственных средств (винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназа) или пяти лекарственных средств (винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназа). Для знакомства с дополнительными способами терапии и дозами см. D. A. Scheinberg et al., «Acute Leukemias.» IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2193-2321 (DeVita et al., eds., 5 th ed. 1997).

Лечение CLL включает в себя химиотерапевтические комбинации СМР, CVP, CHOP, COP и CAP (циклофосфамид, доксорубицин и преднизон). Лечение пациентов с трудноизлечимой CLL включает в себя применение аналогов пурина (например, монофосфата флударабина, 2-хлордезоксиаденозина и пентостатина). См. А. В. Deisseroth et al., «Chronic Leukemias,» IN CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2193-2321 (DeVita et al., eds., 5 th ed. 1997).

Анти-CD20- и анти-CD40-агтитела.

Данное изобретение, кроме того, охватывает комбинирование анти-CD40L-антител, таких как IDEC-131, с анти-CD20-антителами или их терапевтически эффективными фрагментами и/или анти-CD40-антителами или их терапевтически эффективными фрагментами. Предпочтительными анти-CD20-антителами являются RITUXAN® и В1 (см. патент США №5843398). Для знакомства с описанием, получением и применением анти-CD40L (также известными как анти-gр39), см. совместно переуступленные заявки на выдачу патента США с регистрационным №08/554840, поданную 7 ноября 1995, 08/925339, поданную 8 сентября 1997, 09/069871, поданную 30 апреля 1998, и 09/332595, поданную 14 июня 1999, и патент США №5747037. Предпочтительные анти-CD40-антитела и их получение описаны в патентах США №5874085; 5874082; 5801227; 5667165; 5674492 и 5667165, все из которых включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Все обсуждения, касающиеся анти-CD20-антител, приведенные в данном описании, применимы также к анти-CD40-антителам.

Поскольку расстройства В-клеток периферической крови по определению могут требовать необходимости доступа к крови для лечения, предпочтительным путем введения иммунологически активных химерных анти-CD20-антител и радиоактивно меченных анти-CD20-антител является парентеральное введение; в используемом здесь смысле термин «парентеральное» включает в себя внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Из них наиболее предпочтительно внутривенное введение.

Иммунологически активные химерные анти-CD20-антитела и радиоактивно меченные анти-CD20-антитела обычно будут готовить с использованием стандартных способов с фармацевтически приемлемым буфером, например, стерильным физиологическим раствором, стерильной забуференной водой, пропиленгликолем, комбинациями указанного выше и т.д. Способы приготовления парентерально вводимых средств описаны в PHARMACEUTICAL CARRIERS AND FORMULATIONS, Martin, Remington s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1975), которая включена в данное описание в качестве ссылки, или как описано выше.

Конкретное терапевтически эффективное количество иммунологически активных химерных анти-CD20-антител, используемых для получения уникального терапевтического действия у любого данного пациента, можно определить стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области. Эффективные дозы (т.е. терапевтически эффективные количества) иммунологически активных химерных анти-CD20-антител находятся в пределах примерно от 0,001 до 30 мг/кг массы тела, более предпочтительно примерно от 0,01 до 25 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно примерно от 0,4 до 20,0 мг/кг массы тела. При других дозах также сохраняется жизнеспособность. Факторы, влияющие на дозу, включают в себя, но не ограничиваясь этим, тяжесть заболевания; предыдущие подходы к лечению; общее состояние здоровья пациента; возраст пациента; другие присутствующие заболевания и т.д. Специалист в данной области легко справится с оценкой конкретного пациента и определением подходящей дозы, которая попадает в указанные пределы или при необходимости выходит за пределы насколько требуется. Введение иммунологически активных химерных анти-CD20-ангител или другого CD20-антитела (например, RITUXAN® или В1) в указанных пределах доз можно осуществить в виде однократной обработки или на протяжении серии обработок. Что касается химерных антител, предпочтительно, чтобы такое введение было выполнено в ходе серии обработок. Указанный предпочтительный подход продиктован методикой лечения, связанной с данным заболеванием. В действительности, несмотря на то, что однократная доза дает преимущества и ее можно эффективно использовать для лечения/ведения заболевания, предпочтительный курс лечения может осуществляться в несколько стадий; наиболее предпочтительно в пределах примерно от 0,4 и 20 мг/кг массы тела иммунологически активного химерного анти-CD20-антитела или другого анти-CD20-антитела вводят пациенту один раз в неделю в течение примерно от 2 до 10 недель, наиболее предпочтительно в течение примерно 4 недель.

Что касается применения радиоактивно меченных анти-CD20-антител и/или анти-CD40-антител, предпочтительно антитело представляет собой (1) не-химерные антитела или (2) химерные гуманизированные антитела с делегированными доменами или (3) антитела человека. Указанное предпочтение продиктовано значительно более коротким периодом полувыведения из циркуляции антител с делегированными доменами или мышиных антител по сравнению с полными химерными или гуманизированными антителами (т.е. при более продолжительном периоде полувыведения из циркуляции радионуклид присутствует у пациента в течение более длительных периодов времени). Однако радиоактивно меченные химерные антитела можно использовать для лечения с более низкими значениями доз в милликюри («мкюри»), используемыми в связи с немеченным химерным антителом, по отношению к антителу. Указанный план действий позволяет снизить токсичность в костном мозге до приемлемого уровня, сохраняя при этом терапевтическую эффективность. Конкретные радиоактивно меченные химерные формы анти-CD20 можно получить, как описано в патентах США №5776456 и 5843439.

Эффективные однократные лечебные дозы (т.е. терапевтически эффективные количества) меченных иттрием-90 анти-CD20-антител находятся в пределах примерно от 5 до 120 мкюри, более предпочтительно примерно от 10 до 40 мкюри для мышиных антител и примерно от 30 до 100 мкюри для антител с делегированным доменом. Эффективные однократные лечебные дозы меченных иодом-131 анти-CD20-антител, не требующие удаления костного мозга, находятся в пределах примерно от 5 до 70 мкюри, более предпочтительно примерно от 5 до 40 мкюри. Эффективные однократные аблативные дозы (т.е. они могут требовать аутологичной трансплантации костного мозга) меченных иодом-131 анти-CD20-антител находятся в пределах примерно от 30 до 600 мкюри, более предпочтительно примерно от 50 до менее чем 500 мкюри. Что касается химерного анти-CD20-антитела, вследствие более длительного периода полувыведения из циркуляции по сравнению с мышиными антителами, эффективные однократные лечебные дозы меченных иодом-131 химерных анти-CD20-антител, не требующие удаления костного мозга, находятся в пределах примерно от 5 до 40 мкюри, более предпочтительно примерно менее чем 30 мкюри. Критерии визуализации, например, для метки индия-111, обычно составляют примерно менее чем 5 мкюри. Дополнительное обсуждение получения и применения радиоактивно меченных анти-CD20-антител можно найти в патентах США №5843398 и 5843439, и оба патента тем самым включены в виде ссылки в полном объеме.

Радиоктивно меченные антитела.

В отношении применения радиоактивно меченных антител (например, специфичных для CD40, CD40L и/или CD20) предпочтительным является нехимерное антитело; указанное предпочтение продиктовано значительно более продолжительным периодом полувыведения из циркуляции химерных антител по сравнению с мышиными антителами (т.е. при более продолжительном периоде полувыведения из циркуляции радионуклид присутствует у пациента в течение более длительных периодов времени). Однако радиоактивно меченные химерные антитела можно использовать для лечения с более низкими значениями доз в милликюри («мкюри»), используемыми в связи с химерным антителом, по сравнению с мышиным антителом. Указанный план действий позволяет снизить токсичность в костном мозге до приемлемого уровня, сохраняя при этом терапевтическую эффективность.

Множество радионуклидов подходит для данного изобретения, и специалисты в данной области способны легко определить, какой радионуклид наиболее подходит в разных случаях. Например, иод-131 (131I) является хорошо известным радионуклидом, используемым для направленной на мишень иммунотерапии. Однако клиническая пригодность 131I может быть ограничена несколькими факторами, включая период физического полураспада, равный восьми дням; дегалогенирование иодированного антитела, как в крови, так и в местах опухолей; характеристики испускания (например, большой гамма-компонент), которые могут быть субоптимальными для локализованного депонирования дозы в опухоли. С появлением хелатирующих агентов лучшего качества возможность связывания с белками групп, хелатирующих металлы, увеличила возможности применения других радионуклидов, таких как индий-131 ( 131In) и иттрий-90 (90Y). 90Y обладает несколькими преимуществами при использовании в радиоиммунотерапевтических применениях: период полураспада 90Y, равный 64 часам, достаточно продолжительный, чтобы дать возможность антителу накопиться в опухоли, и в отличие, например, от 131I 90 Y является чистым эмиттером бета-излучения высокой энергии, не сопровождаемого гамма-излучением при его распаде, с пределами проникновения в ткани от 100 до 1000 диаметров клетки. Кроме того, минимальное количество проникающей радиации позволяет осуществлять амбулаторное введение меченных 90Y антител. Кроме того, интернализация меченого антитела не требуется для гибели клеток, и локальное испускание ионизирующего излучения должно быть летальным для близлежащих опухолевых клеток, не имеющих антигена-мишени.

Одно не относящееся к терапии ограничения в отношении 90Y основано на отсутствии существенного гамма-излучения, затрудняющем визуализацию. Чтобы избежать указанную проблему, можно использовать диагностический «визуализирующий» радионуклид, такой как индий-111 ( 111In) для определения локализации и относительного размера опухоли перед введением терапевтических доз меченного 90Y анти-CD20. Индий-111 является особенно предпочтительным в качестве диагностического радионуклида, поскольку при дозах в пределах примерно от 1 до 10 мкюри его можно вводить без риска, без видимой токсичности; и данные визуализации, как правило, дают прогноз последующего распределения антитела, меченного 90Y. В большинстве случаев при исследованиях для визуализации используют 5 мкюри меченного 111In антитела, поскольку указанная доза как безопасна, так и обладает повышенной эффективностью при визуализации по сравнению с более низкими дозами, при этом оптимальная визуализация имеет место в период от трех до шести дней после введения антитела. См., например, Murray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985) и Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985).

Эффективные однократные лечебные дозы (т.е. терапевтически эффективные количества) меченных 90Y антител (например, анти-CD40L-, анти-CD20и анти-CD-40-антител) находятся в пределах примерно от 5 до 75 мкюри, более предпочтительно примерно от 10 до 40 мкюри. Эффективные однократные лечебные дозы меченных 131I антител, не требующие удаления костного мозга, находятся в пределах примерно от 5 до 70 мкюри, более предпочтительно примерно от 5 до 40 мкюри. Эффективные однократные аблативные дозы (т.е. они могут требовать аутологичной трансплантации костного мозга) меченных 131 I антител находятся в пределах примерно от 30 до 600 мкюри, более предпочтительно примерно от 50 до менее чем 500 мкюри. Что касается химерного антитела, вследствие более длительного периода полувыведения из циркуляции по сравнению с мышиными антителами эффективные однократные лечебные дозы меченных иодом-131 ( 131I) химерных антител, не требующих удаления костного мозга, находятся в пределах примерно от 5 до 40 мкюри, более предпочтительно примерно менее чем 30 мкюри. Критерии визуализации, например, для метки lllIn, обычно составляют примерно менее чем 5 мкюри.

Что касается радиоактивно меченных антител для терапии, дозирование также может осуществляться с использованием однократной терапевтической обработки или с использованием многократных обработок. Из-за наличия радиоактивного компонента предпочтительно перед обработкой «собрать» периферические стволовые клетки («PSC») или костный мозг («ВМ») у тех пациентов, у которых предполагается потенциально неизбежное токсичное действие на костный мозг, вызванное излучением. ВМ и/или PSC собирают с использованием стандартных способов и затем очищают и замораживают для возможной повторной инфузии. Кроме того, наиболее предпочтительно, чтобы перед обработкой было проведено диагностическое дозиметрическое исследование пациента с использованием диагностического меченого антитела (например, с использованием 111 In), целью которого является получение гарантии того, что терапевтически меченное антитело (например, с использованием 90Y) не станет излишне «концентрироваться» в каком-либо нормальном органе или ткани.

Дополнительные радиоизотопы, которые можно использовать, включают в себя l23 I, 125I, 131In, 32Р, 64Cu, 67 Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47 Sc, 105Rh, 109Pd. 153Sm, 188Re, 199Au, 211At и 213 Bi, Количество доставленного излучения будет частично зависеть от периода полураспада и типа корпускулярного излучения.

В экспериментах, описанных далее, использовали нижеперечисленные материалы и способы. Примеры, приведенные далее, не ограничивают изобретение, которое описано или заявлено, а только представляют варианты заявленного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Свойства клеток В-лимфомы, клеток DHL-4

Идею о том, что анти-CD40L-антитело может блокировать опосредованное CD40L-CD40 выживание злокачественных В-клеток при индуцированной химиотерапией токсичности/апоптозе, проверяли in vitro, используя IDEC-131 и линию клеток В-лимфомы, DHL-4 (Roos et al., Leuk. Res. 10: 195-202 (1986)), подвергнутую воздействию адриамицина (ADM). IDEC-131 является гуманизированной версией мышиного моноклонального антитела против CD40L человека, 24-31.

Сначала определяли минимальную концентрацию ADM, цитотоксичную по отношению к клеткам DHL-4, подвергая клетки DHL-4 в течение 4 часов воздействию разных концентраций ADM. Цитотоксичность по отношению к клеткам DHL-4 после 5 дней культивирования измеряли посредством анализа на основе восстановления красителя Alamar Blue (см. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Meth. 202: 163-171 (1997)). Коротко, 1×10 5 клеток DHL-4 в среде роста (RMPI-1640 плюс 10% фетальной сыворотки теленка) инкубировали с разными концентрациями ADM (от 1×10-6 М до 1×10 -8 М) в пробирках для культур клеток при 37°С в течение 4 часов. После инкубации клетки промывали, снова суспендировали в среде роста в концентрации 1×105 клеток/мл, и 200 мкл суспензии клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном. Планшеты инкубировали при 37°С и тестировали на цитотоксичность в разных временных точках. Во время последних 18 часов инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл окислительно-восстановительного красителя Alamar Blue (Biosource International, № в каталоге DAL 1100). После инкубации планшеты охлаждали путем инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут на встряхивателе и определяли внутриклеточное восстановление красителя. Флуоресценцию регистрировали, используя 96-луночный флуориметр при длине волны возбуждения 530 нм и эмиссии 590 нм. Результаты выражали в относительных единицах флуоресценции (RFU). Процент цитотоксичности рассчитывали следующим образом: [1-(среднее RFU тестируемого образца ÷ среднее RFU контрольных клеток)] × 100%.

Строили кривую титрования цитотоксичности ADM и выбирали минимальные концентрации лекарственного средства для обеспечения цитотоксичности при дальнейших анализах.

Результаты, которые изображены на фиг.1, показывают цитотоксичность по отношению к клеткам DHL-4, культивируемым в течение 5 дней после воздействия ADM (2×10-7 М и 4×10-8 М ADM) в течение 4 часов перед культивированием. Клетки промывали один раз после экспозиции и культивировали в среде роста в течение 5 дней, цитотоксичность определяли с помощью анализа поглощения красителя Alamar Blue, как описано выше. Кроме того, характеризовали клетки DHL-4 по мембранной экспрессии выбранных молекул CD с помощью проточной цитометрии. Обнаружено, что клетки DHL-4 экспрессируют молекулы CD19, CD20, CD40, но не выявлено экспрессии CD40L.

Пример 2

Анти-CD40L-антитело отменяет опосредованную CD40L резистентность клеток В-лимфомы к гибели под действием адриамицина

На фиг.2А показано действие анти CD40L-антитела (IDEC-131) на опосредованную CD40L-CD40 резистентность клеток DHL-4 к клеточной гибели, индуцированной ADM. Клетки DHL-4 (0,5×106 клеток/мл) инкубировали в присутствии 10 мкг/мл растворимого CD40L (sCD40L, P. A.Brams, E.A.Padlan, К.Hariharan, К.Slater, J.Leonard, R.Noelle, and R.Newman, «A humanized anti-human CD154 monoclonal antibody blocks CD154-CD40 mediated human В cell activation» (рукопись подана в печать)) в течение 1 часа при 37°С. После инкубации в течение 1 часа добавляли небольшие концентрации ADM (2×10 -7 М 4×10-8 М) и инкубировали еще 4 часа в присутствии или в отсутствие CD40L (10 мкг/мл). После воздействия ADM клетки промывали и ресуспендировали в среде роста при концентрации 0,5×106 клеток/мл, и 100 мкл суспензии клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном в повторах с sCD40L или без него. sCD40L (10 мкг/мл) добавляли к культурам, которые непрерывно подвергались воздействию sCD40L во время обработки ADM, и к культурам, в которых не было sCD40L во время экспозиции с ADM. Кроме того, к культурам добавляли IDEC-131 в концентрации 10 мкг/мл, для того, чтобы определить его действие на клетки DHL-4, инкубированные с sCD40L и ADM. Через 5 дней измеряли цитотоксичность посредством анализа поглощения красителя Alamar Blue, как описано.

Данные показывают, что SCD40L продлевал выживание клеток DHL-4 после обработки ADM, в то время как, как и ожидалось, повышенную цитотоксичность наблюдали по отношению к клеткам, которые подвергали воздействию ADM в отсутствие SCD40L. Кроме того, добавление анти-CD40L-антитела (IDEC-131) отменяло опосредованное CD40L выживание клеток, приводя к повышению клеточной цитотоксичности (фиг.2А).

Добавление одного только IDEC-131 не оказывало действия на клетки DHL-4, обработанные sCD40L, и это свидетельствует о том, что антитело само по себе не обладает какими-либо прямыми ингибирующими или цитотоксичными активностями по отношению к клеткам DHL-4 (фиг.2В). Клетки DHL-4, предварительно инкубированные с sCD40L или без него, культивировали в присутствии разных концентраций IDEC-131, RITUXAN®, анти-CD20-антитела СЕ 9.1 и анти-CD4 антител (Anderson et al., Clin. Immunol. and Immunopathol. 84: 73-84 (1997)). Через 5 дней определяли цитотоксичность/пролиферацию клеток DHL-4 с помощью анализа на основе Alamar Blue, как описано выше. На фиг.2В показано отсутствие действия IDEC-131 на пролиферацию или цитотоксичность клеток DHL-4, в то время как RITUXAN ®, как и ожидалось, ингибировал пролиферацию клеток и индуцировал цитотоксичность. Не наблюдали эффекта в клетках DHL-4, культивированных с анти-CD4-антителами.

Пример 3

Передача сигнала CD40L-CD40 предотвращает апоптоз клеток В-лимфомы, вызванный анти-CD20-антителом, RITUXAN® 

Влияние опосредованной CD40L-CD40 передачи сигнала на индуцированный анти-CD20-антителом апоптоз клеток В-лимфомы определяли, используя систему in vitro, включающую в себя клетки DHL-4 и поверхность, перекрестно связывающую RITUXAN® . Клетки DHL-4 (от 0,5 до 1×106 клеток/мл) культивировали с sCD40L (10 мкг/мл) при 37°С. После культивирования в течение ночи клетки собирали и инкубировали с 10 мкг/мл RITUXAN ® или контрольного антитела (СЕ 9.1; анти-CD4-антитело) в присутствии или без sCD40L (10 мкг/мл) на льду. После 1-часовой инкубации клетки центрифугировали, чтобы удалить несвязанные антитела, ресуспендировали при концентрации 1×10 6 клеток/мл в среде роста (5% FCS-RPMI) и культивировали в пробирках для культуры ткани. Антитела, связанные с поверхностью клеток, перекрестно связывали посредством впрыскивания F(ab )2-фрагметов антител козы, специфичных против Ig-Fc человека в концентрации 15 мкг/мл, и культуры инкубировали при 37°С вплоть до анализа на апоптоз. Апоптоз регистрировали с использованием анализа каспаэы-3 по методу проточной цитометрии. Культивируемые клетки собирали через 4 и 24 часа, промывали и фиксировали при 4°С, используя Cytofix (Набор Cytofix/Cytoperm ТМ, Phanningen катал. №2075 KK). После фиксации в течение 20 мин клетки промывали и добавляли 15 мкл аффинно очищенного РЕ-конъюгированного поликлонального кроличьего антитела против каспазы-3 (Pharmingen, № в каталоге 67345) и 50 мкл Cytoperm (Pharmingen; № в каталоге 2075KK). Клетки инкубировали на льду в темноте в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали один раз и ресуспендировали в Cytoperm. Данные проточной цитометрии получали на FACScan и анализировали, используя компьютерную программу WinList из Verity Software House.

В таблице 4 показана резистентность индуцированного RITUXAN® апоптоза в лимфомных клетках DHL-4 при воздействии sCD40L. В указанных исследованиях активацию каспазы-3 использовали в качестве замены маркера, так как предварительные исследования авторов показали хорошую корреляцию между анализом каспазы-3 и Tunel-анализом. Перекрестное связывание RITUXAN® на поверхности клеток DHL-4 в присутствии sCD40L снижало уровни апоптоза, в то время как в клетках, не подвергавшихся воздействию sCD40L, происходил апоптоз. При сравнении в культурах, инкубированных в присутствии антитела такого же изотипа, контрольного антитела (СЕ9.1), апоптоз клеток не происходил. Таким образом, данные свидетельствуют о том, что индуцированная sCD40L передача сигнала по пути CD40 может приводить к развитию опосредованной RITUXAN® гибели клеток В-лимфомы.

Таблица 4 
Условия культивирования % Апоптоза (MIF)(a) 
4 часа 24 часа 
Клетки DHL-4, экспонированные с sCD40L 
Только клетки 3,35 (17,42) 4,94 (7,62) 
Клетки + RITUXAN 1,97 (1,97) 4,54 (6,54) 
Клетки + RITUXAN + F(ab )2 антитела против IgG человека 21,17 (17,39) 9,62 (13,44) 
Клетки + СЕ 9.1 2,31 (13,25) 4,15 (7,85) 
Клетки + СЕ9.1 + F(ab )2 антитела против IgG человека 2,09 (22,14) 4,14 (9,57) 
Клетки + F(ab )2 антитела против IgG человека 1,93 (12,57) 5,13 (8,02) 
Клетки DHL-4, не экспонированные с sCD40L 
Только клетки 4,36 (14,34) 5,08 (17,62) 
Клетки + RITUXAN 5,67 (10,66) 1,08 (17,92) 
Клетки + RITUXAN + F(ab )2 антитела против IgG человека 74,82 (22,80) 30,63 (26,84) 
Клетки + СЕ9.1 5,99 (14,00) 3,05 (18,24) 
Клетки + СЕ9.1 + F(ab )2 антитела против IgG человека 5,96 (12,11) 2,24 (18,19) 
Клетки + F(ab )2 антитела против IgG человека 6,09 (12,27) 1,85 (17,27) 
(а) Процент позитивных клеток с активностью каспазы-3 и средняя интенсивность их флуоресценции в логарифмическом масштабе. 


Пример 4

Влияние IDEC-131 на выживание клеток хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL)

Чтобы определить влияние IDEC-131 на рост и выживаемость клеток B-CLL in vitro, клетки B-CLL культивировали in vitro с IDEC-131 или без него в присутствии CD40L. Из крови пациентов с CLL выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) с использованием центрифугирования в градиенте плотности фикол-гипак. Выживаемость определяли посредством способа исключения при окрашивании красителем трипановым синим, и она составляла >98%. Анализы на основе проточной цитометрии показали, что >70% лимфоцитов были CD19 +/CD20+.

Клетки CLL (РВМС) культивировали в среде роста CLL (например, среда RPMI-1640 с добавлением 5% FCS или 2% аутологичной плазмы донора с добавлением 2 мМ L-глутамина и 100 ед./мл пенициллина-стрептомицина). Кроме того, для некоторых экспериментов очищали В-клетки CD19 +, используя шарики CD19+ Dynabeads в соответствии с инструкциями производителя (Dynal, катал. № 111.03/111.04), и культивировали, как описано выше. Клетки CLL или очищенные клетки B-CLL, культивированные в среде роста, обычно подвергались спонтанной апоптозной клеточной гибели. Однако культивирование указанные клеток в присутствии sCD40L продлевало их выживание в культурах. В таблице 5 показана выживаемость клеток B-CLL CD19 +, выращенных в присутствии или в отсутствие sCD40L (5 мкг/мл) в разных временных точках, и показано более продолжительное выживание клеток CLL. Клетки B-CLL пациента №1, культивированные с sCD40L, имели выживаемость > 60% в течение более 2 недель, в то время как клетки, выращенные в отсутствие sCD40L, имели выживаемость менее 10%.

Таблица 5 
Выживаемость В-клеток в присутствии SCD40L 
Образец B-CLL Время (часы) % Выживаемости(а) 
(-)CD40L (+)CD40L 
Пациент № 1 0

48

96

144 90

88

46

30 90

90

77

72 
Пациент № 2 0

48

96

144 90

40

31

17 90

72

65

51 
(a) равно проценту выживаемости, определенному методом исключения с использованием красителя трипанового синего. 


На фиг.3 показано действие IDEC-131 на рост и выживаемость клеток B-CLL после 7 дней культивирования. Очищенные клетки B-CLL от пациента с CLL (2×106 клеток/мл) делили на две пробирки для культивирования. Клетки в одной пробирке смешивали с sCD40L (5 мкг/мл) в равном объеме среды роста, тогда как другую пробирку инкубировали с равным объемом среды роста в качестве контроля. После инкубации в течение 1 часа при 37°С клетки осторожно перемешивали, и 100 мкл среды с суспензией клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном в повторах в присутствии разных концентраций IDEC-131 (от 10 мкг/мл до 0,3 мкг/мл) или без него. Спустя семь дней определяли выживаемость/гибель клеток в культуре, используя анализ на основе Alamar Blue, как описано выше. Результаты показали выживание клеток в культурах с sCD40L. Добавление в культуру IDEC-131 приводило к возрастанию гибели клеток, которое свидетельствовало о переключении выживания клеток на гибель клеток или о сенсибилизации клеток к гибели. Кроме того, RITUXAN® , введенный в той же концентрации, что и IDEC-131, действовал на гибель клеток меньше и на более низком уровне, чем IDEC-131 (фиг.3В).

Пример 5

Опосредованная CD40L-CD40 повышающая регуляция молекул HLA-DR в B-CLL

Чтобы определить, не нарушен ли путь сигнальной трансдукции через CD40L-CD40, клетки CLL от пациентов с CLL культивировали (5×105 клеток/мл) в присутствии и без 5 г/мл CD40L при 37°С. Через 48 часов и 144 часа определяли экспрессию молекулы класса II, HLA-DR на клетках CD19+ проточной цитометрией, используя стандартные способы. Коротко, культивированные лимфоциты собирали в разных временных точках и анализировали в отношении поверхностной экспрессии молекул, используя антитела, связанные либо с флуоресцеином (FITC), либо с фикоэритрином (РЕ) для одиночного или двойного окрашивания, с использованием проточного цитометра FACScan (Becton-Dickinson). Чтобы покрасить для проточной цитометрии 1×106 клеток в пробирках для культивирования инкубировали с соответствующими следующими антителами: анти-CD45-FITC, чтобы пропустить сигнал популяции лимфоцитов на график рассеяния; анти-CD19-РЕ(Phanningen, кат. №30655) или анти-CD20-FITC-антитела (Phanningen; кат. №33264), чтобы определить В-клетки CD19 + и/или CD20+; анти-CD3-FITC-антитела (Phanningen; кат. № 30104), чтобы отбросить сигнал Т-клеток; анти-CD19-RPEи анти-HLA-DR-FITC-антитела (Phanningen; кат. №32384), чтобы определить экспрессию молекул класса II на клетках CD19 +. Клетки один раз промывали центрифугированием (при 200×g, в течение 6 мин) 2 мл холодного PBS и инкубировали с антителом в течение 30 мин на льду, после чего клетки промывали один раз, фиксировали в 0,5% параформальдегиде и хранили при 4°С вплоть до анализа. Данные проточной цитометрии получали на FACsan и анализировали, используя компьютерную программу WinList software (Verity Software House). Прибор был настроен на автопропускание сигнала, чтобы обеспечить обследование квадрантов, содержащих клетки, которые были подвергнуты одиночному окрашиванию либо RPE, либо FITC, не окрашивались или подергались двойному окрашиванию. На фиг.4 показано сравнение экспрессии HLA-DR в клетках CD19 +-CLL, культивированных с sCD40L, и в тех клетках, которые не культивировали с sCD40L. Выявили высокий уровень экспрессии HLA-DR на клетках B-CLL, культивированных в присутствии sCD40L (таблица 6).

Таблица 6 
Опосредованная CD40L-CD40 повышающая регуляция молекулы HLA-DR в B-CLL 
Образец Время HLA-DR+(a) 
% позитивных MFI 
Контроль 48 час 81 92 
144 час 88 1655 
Клетки + sCD40L 48 час 88 101 
144 час 95 2943 
(а) В-клетки CD19+ ,которые позитивны в отношении молекул HLA-DR, и средняя интенсивность их флуоресценции (MIF). 


Пример 6

Обработка IDEC-131 и RITUXAN®

Для лечения злокачественной опухоли CD404 субъекту внутривенно (в/в) вводят IDEC-131 в концентрации примерно от 10 до 50 мг/мл в буфере композиции: 10 мМ Na-цитрат, 150 мМ Nal, 0,02% полисорбат 80, при рН 6,5. IDEC-131 вводят до, после или вместе с RITUXAN®. Дозы вводимого RITUXAN® находятся в пределах примерно от 3 до 10 мг/кг массы субъекта.

Пример 7

Обработка IDEC-131 и RITUXAN ®

Для лечения злокачественных опухолей CD40 +, чувствительных к CHOP (например, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы и хронического лимфоцитарного лейкоза, а также при терапии спасения при злокачественных опухолях, в которых клетки представляют собой клетки CD40+), IDEC-131 вводят путем инфузии в дозах, заключенных примерно от 3 до 10 мг на кг массы пациента непосредственно перед началом цикла CHOP. Введение IDEC-131 будет повторяться перед каждым циклом CHOP всего в течение от 4 до 8 циклов.

Пример 8

Введение анти-CD40L в комбинации с RITUXAN® для лечения В-клеточной димфомы у субъекта

Комбинированная терапия особенно полезна в качестве терапии спасения или для лечения рецидивирующих или агрессивных форм злокачественных опухолей CD40 + (например, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы и CLL). Когда IDEC-131 вводят в комбинации с CHOP и RITUXAN ®, IDEC-131 вводят так, как обсуждалось выше в примере 6, после чего по схеме, специфичной для введения CHOP-IDEC-131, описанного в примере 7.

Все обсуждавшиеся выше ссылки таким образом включены в виде ссылки в полном объеме.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ лечения злокачественной опухоли CD40 +, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, который связывается с CD40L и который ингибирует взаимодействие CD40/CD40L или передачу сигнала через CD40.

2. Способ по п.1, где злокачественной опухолью CD40+ является В-клеточная лимфома или В-клеточный лейкоз.

3. Способ по п.2, где В-клеточная лимфома представляет собой болезнь Ходжкина (БХ) или неходжкинскую лимфому (НХЛ).

4. Способ по п.3, где НХЛ является НХЛ низкой степени, промежуточной степени или высокой степени злокачественности.

5. Способ по п.3, где НХЛ выбрана из группы подтипов, состоящей из мелкоклеточной лимфоцитарной, фолликулярной и преимущественно из мелких клеток с расщепленными ядрами, фолликулярной из смеси мелких клеток с расщепленными ядрами и крупных клеток, фолликулярной и преимущественно крупноклеточной, диффузной из мелких клеток с расщепленными ядрами, диффузной из смеси мелких и крупных клеток, диффузной крупноклеточной, крупноклеточной иммунобластной, лимфобластной, из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта, лимфомы, связанные со СПИДом, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, лимфомы мантийных клеток и моноцитоидной В-клеточной лимфомы.

6. Способ по п.2, где В-клеточным лейкозом является хронический В-клеточный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз В-клеточной линии или хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеточной линии.

7. Способ по п.2, где антителом или фрагментом антитела, который связывается с CD40L, является IDEC-131, 3E4, 2Н5, 2Н8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 или 89-79.

8. Способ по п.7, где антитело или фрагмент антитела является химерным, биспецифичным, человеческим или гуманизированным.

9. Способ по п.2, где фрагментом антитела является Fab, Fab', scFv или F(ab') 2.

10. Способ по п.2, дополнительно включающий в себя введение терапевтически эффективного количества второго антитела или его фрагмента, где вторым антителом является анти-СD20-антитело или анти-СD40-антитело, химиотерапевтического средства, комбинации химиотерапевтических средств и/или применение лучевой терапии.

11. Способ по п.10, где лучевая терапия представляет собой наружную обработку излучением или радиоактивно меченное антитело.

12. Способ по п.11, где радиоактивно меченным антителом является радиоактивно меченное антитело IDEC-131, ритуксимаб или В1, или их фрагменты.

13. Способ по п.12, где радиоактивно меченное антитело радиоактивно метят с помощью 123 I, 125I, 131I, 111In, 131In, 32 Р, 64Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90 Y, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153 Sm, 188Re, 199Au, 211At и 213Bi.

14. Способ по п.10, где химиотерапевтическим средством для лечения БХ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, алкалоид Vinca, прокарбазин, метотрексат или преднизон.

15. Способ по п.10, где химиотерапевтическим средством для лечения НХЛ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, циклофосфамид, хлорамбуцил, 2-CDA, 2'-дезоксикоформицин, флударабин, цитозинарабинозид, цисплатин, этопозид или ифосфамид.

16. Способ по п.10, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения БХ представляет собой МОРР, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP плюс ABVD, МОРР плюс ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, СЕР, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, СЕМ, МТХ-СНОР, EVAP или EPOCH.

17. Способ по п.10, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения НХЛ представляет собой CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-ВОР, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) или CAMP.

18. Способ по п.10, где химиотерапевтическим средством для лечения В-клеточного лейкоза является любое одно или более из следующих средств: антрациклин, циклофосфамид, L-аспаргиназа и аналог пурина.

19. Способ по п.10, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения В-клеточного лейкоза представляет собой винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназу; винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназу; CHOP; CMP; CVP; COP или CAP.

20. Способ по п.10, где вторым антителом является анти-СD20-антитело.

21. Способ по п.20, где анти-СD20-антителом является ритуксимаб или его фрагмент, или В1 или его фрагмент.

22. Способ лечения злокачественной опухоли CD40 +, включающий в себя стадию введения анти-СD40L-антитела или его фрагмента, который блокирует взаимодействие CD40-CD40L или ингибирует передачу сигнала через CD40; и введение анти-СD20-антитела или его фрагмента.

23. Способ по п.22, где злокачественной опухолью CD40+ является В-клеточная лимфома или В-клеточный лейкоз.

24. Композиция для лечения злокачественной опухоли CD40+, включающая в себя антагонист CD40L и по меньшей мере один из следующих компонентов: (а) химиотерапевтическое средство или комбинацию химиотерапевтических средств, (b) радиоактивно меченное антитело, (с) анти-СD20-антитело или его фрагмент и (d) анти-СD40-антитело или его фрагмент.

25. Композиция по п.24, где радиоактивно меченное антитело радиоактивно метят с помощью 123I, 125 I, 131I, 111In, 131In, 32Р, 64 Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 186Re, 212Pb, 212 Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211 At и 213Bi.

26. Композиция по п.24, где злокачественная опухоль CD40+ представляет собой В-клеточный лейкоз или В-клеточную лимфому.

27. Композиция по п.26, где В-клеточная лимфома представляет собой БХ или НХЛ.

28. Композиция по п.27, где НХЛ является НХЛ низкой степени, промежуточной степени или высокой степени злокачественности.

29. Композиция по п.27, где НХЛ выбрана из группы, состоящей из следующих подтипов: мелкоклеточной лимфоцитарной, фолликулярной и преимущественно из мелких клеток с расщепленными ядрами, фолликулярной из смеси мелких клеток с расщепленными ядрами и крупных клеток, фолликулярной и преимущественно крупноклеточной, диффузной из мелких клеток с расщепленными ядрами, диффузной из смеси мелких и крупных клеток, диффузной крупноклеточной, крупноклеточной иммунобластной, лимфобластной, из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта, лимфом, связанных со СПИД, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, лимфомы мантийных клеток и моноцитоидной В-клеточной лимфомы.

30. Композиция по п.26, где В-клеточным лейкозом является хронический В-клеточный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз В-клеточной линии или хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеточной линии.

31. Композиция по п.24, где антагонистом CD40L является анти-СD40L-антитело или его фрагмент.

32. Композиция по п.31, где анти-СD40L-антителом является IDEC-131 или его фрагмент.

33. Композиция по п.31, где фрагментом анти-СD40L является Fab, Fab', scFv или F(ab') 2.

34. Композиция по п.24, где анти-СD20-антителом является ритуксимаб или его фрагмент, или В1 или его фрагмент.

35. Композиция по п.27, где химиотерапевтическим средством для лечения БХ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, алкалоид Vinca, прокарбазин, метотрексат или преднизон.

36. Композиция по п.27, где химиотерапевтическим средством для лечения НХЛ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, циклофосфамид, хлорамбуцил, 2-CDA, 2'-дезоксикоформицин, флударабин, цитозинарабинозид, цисплатин, этопоэид или ифосфамид.

37. Композиция по п.27, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения БХ представляет собой МОРР, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP плюс ABVD, МОРР плюс ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, СЕР, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, СЕМ, МТХ-СНОР, EVAP или EPOCH.

38. Композиция по п.28, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения НХЛ представляет собой CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-ВОР, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) или CAMP.

39. Композиция по п.28, где химиотерапевтическим средством для лечения В-клеточного лейкоза является антрациклин, циклофосфамид, L-аспаргиназа, аналог пурина.

40. Композиция по п.27, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения В-клеточного лейкоза представляет собой винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназу; винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназу; CHOP; CMP; CVP; COP или CAP.

41. Композиция для лечения злокачественной опухоли CD40 +, содержащая (i) анти-СD40L-антитело или фрагмент указанного антитела, составленная для применения в комбинации с любым одним или несколькими из следующих компонентов: (ii) радиоактивно меченным антителом, которое связывает CD40L или CD20, (iii) анти-СD20-антителом или его фрагментом или (iv) химиотерапевтическим средством или комбинацией химиотерапевтических средств.

42. Композиция для лечения злокачественной опухоли CD40+ по п.41, где злокачественная опухоль представляет собой В-клеточную лимфому или В-клеточный лейкоз.

43. Композиция по п.42, где В-клеточная лимфома представляет собой болезнь Ходжкина или НХЛ.

44. Композиция по п.41, где радиоактивно меченным антителом является радиоактивно меченное антитело IDEC-131, RITUXAN ® или В1.

45. Композиция по п.44, где радиоактивно меченное антитело радиоактивно метят 123 I, 125I,131I, 115In, 131In, 32 P, 64Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90 Y, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153 Sm, 188Re, 199Au, 211At и 213Bi.

46. Композиция по п.43, где НХЛ является НХЛ низкой степени, промежуточной степени или высокой степени злокачественности.

47. Композиция по п.43, где НХЛ выбрана из группы, состоящей из следующих подтипов НХЛ: мелкоклеточной лимфоцитарной, фолликулярной и преимущественно из мелких клеток с расщепленными ядрами, фолликулярной из смеси мелких клеток с расщепленными ядрами и крупных клеток, фолликулярной и преимущественно крупноклеточной, диффузной из мелких клеток с расщепленными ядрами, диффузной из смеси мелких и крупных клеток, диффузной крупноклеточной, крупноклеточной иммунобластной, лимфобластной, из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта, лимфом, связанных со СПИД, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, лимфомы мантийных клеток и моноцитоидной В-клеточной лимфомы.

48. Композиция по п.41, где анти-СD40L-антителом является IDEC-131 или его фрагмент.

49. Композиция по п.41, где анти-СD20-антителом является ритуксимаб или его фрагмент, или В1 или его фрагмент.

50. Композиция по п.42, где химиотерапевтическим средством для лечения БХ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, алкалоид Vinca, прокарбазин, метотрексат или преднизон.

51. Композиция по п.43, где химиотерапевтическим средством для лечения НХЛ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, циклофосфамид, хлорамбуцил, 2-CDA, 2'-дезоксикоформицин, флударабин, цитозинарабинозид, цисплатин, этопозид или ифосфамид.

52. Композиция по п.43, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения БХ представляет собой МОРР, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP плюс ABVD, МОРР плюс ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, СЕР, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, СЕМ, МТХ-СНОР, EVAP или EPOCH.

53. Композиция по п.43, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения НХЛ представляет собой CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-ВОР, m-BACOD, ProMACE-МОРР, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) или CAMP.

54. Композиция по п.42, где химиотерапевтическим средством для лечения В-клеточного лейкоза является антрациклин, циклофосфамид, L-аспаргиназа, аналог пурина.

55. Композиция по п.42, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения В-клеточного лейкоза представляет собой винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназу; винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназу; CHOP; CMP; CVP; COP или CAP.

56. Способ лечения злокачественной опухоли CD40 +, включающий в себя введение антагониста CD40L и по меньшей мере одно из следующих воздействий: (а) введение химиотерапевтического средства или комбинации химиотерапевтических средств, (б) лучевой терапии, (в) введение анти-СD20-антитела или его фрагмента и (г) введение анти-СD40-антитела или его фрагмента.

57. Способ по п.56, где лучевая терапия представляет собой наружную обработку излучением или обработку радиоактивно меченным антителом.

58. Способ по п.57, где радиоактивно меченное антитело радиоактивно метят с помощью 123I,125 I,131I, 111In, 131In,32P, 64 Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 186Re, 212Pb, 212 Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211 At и 213Bi.

59. Способ по п.56, где злокачественная опухоль CD40+ представляет собой В-клеточный лейкоз или В-клеточную лимфому.

60. Способ по п.59, где В-клеточная лимфома представляет собой БХ или НХЛ.

61. Способ по п.60, где НХЛ является НХЛ низкой степени, промежуточной степени или высокой степени злокачественности.

62. Способ по п.60, где НХЛ выбрана из группы, состоящей из следующих подтипов: мелкоклеточной лимфоцитарной, фолликулярной и преимущественно из мелких клеток с расщепленными ядрами, фолликулярной из смеси мелких клеток с расщепленными ядрами и крупных клеток, фолликулярной и преимущественно крупноклеточной, диффузной из мелких клеток с расщепленными ядрами, диффузной из смеси мелких и крупных клеток, диффузной крупноклеточной, крупноклеточной иммунобластной, лимфобластной, из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта, лимфом, связанных со СПИД, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, лимфомы мантийных клеток и моноцитоидной В-клеточной лимфомы.

63. Способ по п.60, где В-клеточным лейкозом является хронический В-клеточный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз В-клеточной линии или хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеточной линии.

64. Способ по п.56, где антагонистом CD40L является анти-СD40L-антитело или его фрагмент.

65. Способ по п.64, где анти-СD40L-антителом является IDEC-131 или его фрагмент.

66. Способ по п.64, где фрагментом анти-CD40L является Fab, Fab', scFv или F(ab') 2.

67. Способ по п.56, где анти-СD20-антителом является ритуксимаб или его фрагмент или В1 или его фрагмент.

68. Способ по п.67, где химиотерапевтическим средством для лечения БХ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, алкалоид Vinca, прокарбазин, метотрексат или преднизон.

69. Способ по п.56, где химиотерапевтическим средством для лечения НХЛ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, циклофосфамид, хлорамбуцил, 2-CDA, 2'-дезоксикоформицин, флударабин, цитозинарабинозид, цисплатин, этопозид или ифосфамид.

70. Способ по п.60, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения БХ представляет собой МОРР, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP плюс ABVD, МОРР плюс ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, СЕР, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, СЕМ, МТХ-СНОР, EVAP или EPOCH.

71. Способ по п.60, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения НХЛ представляет собой CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-ВОР, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) или CAMP.

72. Способ по п.59, где химиотерапевтическим средством для лечения В-клеточного лейкоза является антрациклин, циклофосфамид, L-аспаргиназа и аналог пурина.

73. Способ по п.59, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения В-клеточного лейкоза представляет собой винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназу; винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназу; CHOP; CMP; CVP; COP или CAP.

74. Применение анти-СD40L-антитела или его фрагмента для производства лекарственного средства для использования при лечении злокачественной опухоли CD40+ в комбинации (i) с радиоактивно меченным антителом, которое связывает CD40L или CD20, (ii) с анти-СD40L-антителом или его фрагментом или (iii) с химиотерапевтическим средством или комбинацией химиотерапевтических средств.

75. Применение по п.74, где злокачественной опухолью CD40+ является В-клеточная лимфома или В-клеточный лейкоз.

76. Применение по п.75, где В-клеточная лимфома представляет собой болезнь Ходжкина (БХ) или неходжкинскую лимфому (НХЛ).

77. Применение по п.74, где радиоактивно меченным антителом является радиоактивное меченное антитело IDEC-131, ритуксимаб или В1.

78. Применение по п.74, где радиоактивно меченное антитело радиоактивно метят с помощью 123I, 125 I, 131I, 115In, 131In, 32P, 64 Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 186Re, 212Pb, 212 Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211 At и 213Bi.

79. Применение по п.76, где НХЛ является низкой степени, промежуточной степени или высокой степени злокачественности.

80. Применение по п.76, где НХЛ выбрана из группы, состоящей из следующих подтипов: мелкоклеточной лимфоцитарной, фолликулярной и преимущественно из мелких клеток с расщепленными ядрами, фолликулярной из смеси мелких клеток с расщепленными ядрами и крупных клеток, фолликулярной и преимущественно крупноклеточной, диффузной из мелких клеток с расщепленными ядрами, диффузной из смеси мелких и крупных клеток, диффузной крупноклеточной, крупноклеточной иммунобластной, лимфобластной, из мелких клеток с нерасщепленными ядрами типа Беркитта и не-Беркитта, лимфом, связанных со СПИД, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, лимфомы мантийных клеток и моноцитоидной В-клеточной лимфомы.

81. Применение по п.74, где анти-СD40L-антителом является IDEC-131 или его фрагмент.

82. Применение по п.74, где анти-СD20-антителом является ритуксимаб или его фрагмент, или В1 или его фрагмент.

83. Применение по п.76, где химиотерапевтическим средством для лечения БХ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, алкалоид Vinca, прокарбазин, метотрексат или преднизон.

84. Применение по п.76, где химиотерапевтическим средством для лечения НХЛ является какое-либо одно или несколько из следующих средств: алкилирующий агент, циклофосфамид, хлорамбуцил, 2-CDA, 2'-дезоксикоформицин, флударабин, цитозинарабинозид, цисплатин, этопозид или ифосфамид.

85. Применение по п.76, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения БХ представляет собой МОРР, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP плюс ABVD, МОРР плюс ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, СЕР, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, СЕМ, МТХ-СНОР, EVAP или EPOCH.

86. Применение по п.76, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения НХЛ представляет собой CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-ВОР, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) или CAMP.

87. Применение по п.75, где химиотерапевтическим средством для лечения В-клеточного лейкоза является антрациклин, циклофосфамид, L-аспаргиназа и аналог пурина.

88. Применение по п.75, где комбинация химиотерапевтических средств для лечения В-клеточного лейкоза представляет собой винкристин, преднизон, антрациклин и циклофосфамид или аспаргиназу; винкристин, преднизон, антрациклин, циклофосфамид и аспаргиназу; CHOP; CMP; CVP; COP или CAP.