СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА


RU (11) 2114623 (13) C1

(51) 6 A61K31/68, A61K31/375 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1998.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 96123177/14 
(22) Дата подачи заявки: 1996.12.04 
(45) Опубликовано: 1998.07.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. 6th Jnternational Symposium on Dioxygen and Homogeneous Catalyt ic Oxidation, the Netherland, Nordwijkerhout, 14-19 April, 1996, p. 2 13-21 4. 2. Гарин А.М. и др. Справочник практической химиотерпии опухо лей. - М.: 1995, с. 40, 57-58 и 61. 
(71) Имя заявителя: Государственный научный центр Российской Федерации "НИОПИК"; Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена 
(72) Имя изобретателя: Ворожцов Г.Н.; Калия О.Л.; Кузьмин С.Г.; Лукьянец Е.А.; Немцова Е.Р.; Оганезов В.К.; Панкратов А.А.; Чиссов В.И.; Якубовская Р.И. 
(73) Имя патентообладателя: Государственный научный центр Российской Федерации "НИОПИК"; Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена 

(54) СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА 

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к способам подавления роста злокачественных опухолей. Для этого используют известные цитостатические средства в сочетании со смесью, состоящей из октакарбоксифталоцианина кобальта или оксикобаламина и аскорбината натрия, при молярном соотношении компонентов 1 : 20 - 40. Способ обладает высокой эффективностью при уменьшении токсичности. 6 табл., 6 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к подавлению роста злокачественных опухолей.

Широко известен способ подавления опухолевого роста с применением цитостатических средств, таких как, например, цисдихлордиаминоплатина (ДДП), фарморубицин, таксол [2].

Этот способ используется для лечения солидных опухолей различной локализации, но применяющиеся в нем цитостатики в терапевтически эффективных дозах и режимах обладают высокой токсичностью, проявляющейся в отношении жизненно важных органов [2].

Задачей настоящего изобретения является изыскание способа, который бы обеспечил повышение терапевтической эффективности при уменьшении токсичности.

Для решения этой задачи предложен способ подавления опухолевого роста, включающий применение цитостатических средств и смеси октакарбоксифталоцианина кобальта (ОКФК) или оксикобаламина с аскорбинатом натрия (AKNa) при молярном соотношении 1:20 - 40.

При увеличении указанного соотношения резко возрастает токсичность, а при уменьшении-снижается эффективность.

Хотя известно, что комплекс кобальта с замещенными фталоцианинами или производные коррина с аскорбиновой кислотой могут применяться для предотвращения опухолевого роста [1], однако нельзя было заранее предсказать эффективность способа с применением известных цитостатических средств в сочетании с вышеупомянутыми препаратами.

Неожиданно было обнаружено, что предлагаемый способ обеспечивает повышение терапевтической эффективности при уменьшении токсичности.

Цитотоксическую активность препаратов, применяемых в предложенном способе, определяли в соответствии с методикой 1.

Методика 1.

Определение цитотоксической активности препаратов проводят с использованием биотеста, основанного на ингибировании пролиферации перевивной культуры клеток аденокарциномы легкого человека А-549, обусловленном воздействием цитотоксических агентов.

Для культивирования клеток линии А-549 используют среду Игла с добавлением 100 мкг/мл гентамицина и 10%-ного раствора эмбриональной телячьей сыворотки, предварительно инактивированной нагреванием. Культивирование клеток проводят в стандартных условиях: при 37oC в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода.

При постановке цитотоксического биотеста в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета ("Sarstedt", США) вносят по 100 мкл суспензии клеток линии А-549 в концентрации 1,0 105 клеток/мл и к началу фазы логарифмического роста добавляют тестируемые препараты в объеме 100 мкл/лунку.

Цитотоксическую активность тестируемых препаратов оценивают колориметрическим методом, основанным на способности митохондриальных дегидрогеназ живых тест-клеток восстанавливать экзогенно вносимый растворимый бромид 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия (МТТ, "Sigma Chemical Co, США) в нерастворимый кристаллический формазан. При этом в каждую лунку 96-луночного микропланшета вносят по 20 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл, после чего центрифугируют клеточные культуры, удаляют из лунок весь объем культуральной среды. Для солюбилизации окрашенных продуктов реакции (кристаллов формазана) в каждую лунку микропланшета вносят по 150 мкл диметилсульфоксида ("Sigma") и инкубируют микропланшеты при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. Результаты учитывают по поглощению при длине волны 550 нм на миниридере "Dynatech" (ФРГ).

Уровни ингибирования пролиферации клеточных культур препаратами, тестируемыми на цитотоксическую активность, вычисляют по формуле

,

где

ИП - уровень ингибирования пролиферации;

П0 - уровень пролиферации в опыте (с препаратами): поглощение красителя в опытных образцах:

Пк - уровень пролиферации в контроле (без препаратов): поглощение красителя в контрольных образцах.

Определяют также:

ИК50 - (интегральный показатель цитотоксической активности) - концентрация цитотоксического агента, при которой наблюдается ингибирование пролиферации культуры клеток на 50%.

ТВ (терапевтический выигрыш) - выраженное в процентах изменения ИК50 цитостатика в присутствии каталитической пары относительно ИК50 индивидуального цитостатика.

Испытание предложенного способа "in vivo" проводили в соответствии с методикой 2.

Методика 2.

Для испытания использовали мышей линии СВА, самцов с асцитной опухолью Эрлиха (АОЭ).

АОЭ прививали внутрибрюшинно (в/б) в количестве 0,1 мл асцитной жидкости, взятой на 7-й день роста опухоли. День перевивки считали нулевым днем роста опухоли. Лечение начинали через 24 ч после перевивки опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению продолжительности жизни животных (УПЖ), вычисленному по формуле:

УПЖ = [(СПЖопыт - СПЖконтр.)/СПЖконтр.] 100%

где

СПЖопыт. - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе,

СПЖконтр. - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе.

Биологически значимым эффектом считали УПЖ > 25% при условии достоверно отличающихся СПЖ.

Испытание цитотоксических свойств препаратов, предлагаемых для настоящего способа.

Пример 1 - 3. Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1: 20, 1: 30, 1:40 и ДДП в виде аптечного препарата ("Платидиам", ДДП, Чехия) в концентрации 5 мкг/мл и проводят испытания в соответствии с методикой 1. Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК - AKNa на ДДП приведена в таблице 1, а также на фиг. 1.

Примеры 4 - 6.

Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1:20, 1: 30, 1:40 и фарморубицин (концентрация 0,15 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 2 и на фиг. 2.

Примеры 7 - 8. Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и ARNa в молярном соотношении 1:20, 1:30, 1:40 и таксол (концентрация 0,01 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 3 и на фиг. 3.

Примеры 10 - 12. Берут оксикобаламин (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1: 20, 1: 30, 1:40 и фарморубицин (концентрация 0,1 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 4 и на фиг. 4.

Примеры 13 - 15. Берут оксикобаламин (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1:20, 1:30, 1:40 и таксол (концентрация 0,01 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции оксикобаламина и AKNa приведена в таблице 5 и на фиг. 5.

Испытание способа в соответствии с изобретением "in vivo"

Испытания проводили в соответствии с методикой 2. Для испытания использовали аптечный препарат ДДП, опытно-промышленный препарат ОКФК и аптечный препарат аскорбиновой кислоты, нейтрализованный ex tempore (т.е. AKNa), который вводили в/б в молярном соотношении ОКФК:AKNa = 1:20, 1:30, 1:40.

Контрольные животные получали:

1-я группа - 0,9% раствор NaCl;

2-я группа - ДДП (4 мг/кг);

3-я группа - ОКФК (50 мг/кг);

4-я группа - AKNa (160 мг/кг);

5-я группа - AKNa (240 мг/кг);

6-я группа - AKNa (320 мг/кг);

7-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:20;

8-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:3;

9-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:40.

Опытные животные получили:

10-я группа ДДП (4мг/кг _ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (160 мг/кг)]

11-я группа ДДП (4 мг/кг) _ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (240 мг/кг)]

12-я группа ДДП (4 мг/кг) _ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (320 мг/кг)]

Противоопухолевый эффект оценивали в соответствии с методикой 2. Результаты испытаний в таблице 6 и на фиг. 6.

Таким образом, как видно из таблиц 1-6 и фиг. 1-6, предлагаемый способ обеспечивает эффективное подавление опухолевого роста при снижении токсичности, обусловленном применением известных токсичных цитостатических средств в минимальных дозах: ИК50 для ДДП, таксола и фарморубицина при традиционном применении составляет соответственно 6,4; 9,5 и 0,27 мкг/мл, а при их применении по предлагаемому способу может быть снижено до 2,2; 0,0045 и 0,07 мкг/мл. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ подавления опухолевого роста с применением цитостатических средств, отличающийся тем, что дополнительно применяют смесь октакарбоксифталоцианина кобальта или оксикобаламина с аскорбинатом натрия при молярном соотношении 1 : 20 - 40.