СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ ОТ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО НЕВУСА ХОРИОИДЕИ

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ ОТ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО НЕВУСА ХОРИОИДЕИ


RU (11) 2147129 (13) C1

(51) 7 G01N33/53, G01N33/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.03.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 98121042/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.11.17 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.11.17 
(45) Опубликовано: 2000.03.27 
(56) Аналоги изобретения: Котелянский Э.О. и др. Сборник научных работ: Офтальмоонкология.-М., 1983, с. 68-72. SU 1727074 A1, 15.04.92. SU 1232264 A1, 23.05.84. RU 2088940 C1, 27.08.97. US 4591572 A, 27.05.86. JP 59090052 A, 24.05.84. KSANDER B.R., GEER D.C., CHEN P.W. et al., UVEAL MELANOMAS CO NTAIN ANTIGENICALLY SPESIFIC AND NON-SPECIFIC INFILTRATING LYM PHOCYTES, CURR-EYE-RES, 1998, N1, FE B, 17(2), 165-173. 
(71) Имя заявителя: Московский НИИ глазных болезней им.Гельмгольца 
(72) Имя изобретателя: Лихванцева В.Г.; Юровская Н.Н.; Гришина Е.Е. 
(73) Имя патентообладателя: Московский НИИ глазных болезней им.Гельмгольца 
(98) Адрес для переписки: 103064, Москва, ул.Садовая-Черногрязская, 14/19, МНИИ ГБ 

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ ОТ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО НЕВУСА ХОРИОИДЕИ 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и касается способа дифференциальной диагностики увеальной меланомы от прогрессирующего невуса хориоидеи. Сущность изобретения состоит в определении уровня CD16+ киллерных клеток в сыворотке крови и их удельной активности и при их одновременном повышении за пределы нормы диагностируют начальную увеальную меланому, а при отсутствии изменений - прогрессирующий невус хориоидеи. Технический результат заключается в объективизации и точности диагностики. 2 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии и предназначено для повышения эффективности и качества диагностики с целью проведения своевременного и адекватного лечения.

В настоящее время проведение дифференциальной диагностики между невусом хориоидеи значительных размеров и начальной увеальной меланомой остается чрезвычайно актуальной задачей. Для ее решения используются все существующие современные методы исследования, включающие клинико-анамнестические, функциональные (компьютерная периметрия, визометрия) и инструментальные методы исследования (прямая и обратная офтальмоскопия, ядерно-магнитный резонанс, ультразвуковые исследования в двух- и трехмерном изображении, флюоресцентная ангиография, компьютерная томография, интраоперационная биопсия с проведением срочного гистологического исследования биоптата или радиоизотопная диагностика с использованием P32-тестирования).

Сложность проведения дифференциальной диагностики заключается в сходстве клинической картины глазного дна, обусловленной единством происхождения (единством клетки-родоначальника - меланоцита) при невусе хориоидеи и увеальной меланоме, накладывающимися на нее сходными клиническими симптомами и данными инструментального обследования.

Невус хороидеи встречается по данным различных авторов от 5 до 10% при аутопсии глаз (Tumors of the Eye and Ocular Adnexa. - p. 242. - by Jan W. McLean, Miguel N. Burnier, Lorenz E. Zimmerman. AFIP, Washington 1993). Его часто принимают за начальную опухоль. И, наоборот, принимая начальную опухоль за невус хориоидеи, офтальмологи часто оставляют пациента на продолжительный срок без наблюдения и упускают сроки для проведения эффективного лечения. Вместе с тем, в случае увеальной меланомы, когда процесс метастазирования может произойти на любой стадии опухолевого роста, этот срок может оказаться решающим для начала органной инвазии.

Дифференциальная диагностика настолько сложна, что некоторые офтальмологи в Европе и США предпочитают лечить маленькие опухоли ad priore фотокоагуляцией или брахитерапией без гистологического подтверждения диагноза, считая, что лучше гипердиагностировать, чем пропустить опухоль [там же, стр. 247]. Однако не следует забывать, что вышеупомянутые методы лечения достаточно часто сопровождаются осложнениями различного рода и характера. Например, фотокоагуляция может вызвать отслойку сетчатки (при передозировке мощности излучения в процессе коагуляции с образованием дырки в сетчатке) или обширные кровоизлияния в сетчатку при повреждении интраретинальных сосудов. А брахитерапия может вызвать склеромаляцию, постлучевую хориоретинопатию, нейроретинопатию или иридоциклит в зависимости от локализации опухоли и, следовательно, места и дозы облучения. В литературе также описаны случаи пострадиационного эндофтальмита [Зарубей Г.Д. Радиотерапия опухолей глаза. - стр. 13 - докт. дисс. - Москва. - 1982 г]. Проведение лечения любым из указанных методов сопровождается снижением зрительных функций, а следовательно, и качества жизни больных. Все вышеперечисленное заставляет глубже заглянуть в проблему дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы.

Невус хориоидеи при проминенции до 1,5 мм и диаметром менее 10 мм2, протекает бессимптомно. Его находят случайно на профилактических осмотрах при офтальмоскопии. Но тщательная периметрия, тем не менее, у многих из них обнаруживает дефекты в поле зрения, как и при начальной увеальной меланоме [Edward Jackson Memorial lection Problems in the differential diagnosis nevi and malignant melanomas. Am J. Ophthalmol 1977; 83 : 299-323].

Гистологические данные выявляют дегенеративные изменения в тканях, прилежащих к невусу, которые и обуславливают дефекты в поле зрения. Самыми ранними проявлениями являются компрессия и облитерация хориокапилляров хориоидеи с последующим формированием друз в пигментном эпителии сетчатки и серозной отслойкой пигментного эпителия, а впоследствии отслойкой нейросенсорной сетчатки. Затем присоединяется дегенерация пигментного эпителия и фоторецепторных клеток [Naumann G. et al "Histogenesis of malignant melanomas of uvea. Histopathologic characteristics of nevi of the chotoid and ciliary body". Arch Ophthalmol 1966 vol. 76, p. 784-96; Naumann G. et al Pigmanted nevi of the choroid: clinical study of secondary changes in the overlying tissue. Trans Am Ophthalmol Otolaryngol 1971; vol. 75: p 110-123].

В ряде случаев проминенция невуса достигает 3 мм. Такие невусы в 100% случаев сопровождаются дефектами в поле зрения. Их называют подозрительными и рекомендуют наблюдение за ними с частыми посещениями окулиста. Возможен рост невуса или его перерождение (в 10% случаев) [Shields and Shields C. Intraocular Tumors. A text and atlas. Philadelphia: p. 123 WB Saunders, 1992]. С возрастом вероятность перерождения увеличивается.

Поля оранжевого пигмента на поверхности таких подозрительных невусов, представляющие глыбки отложенного липофусцина, также зачастую присутствуют, хотя гораздо чаще они ассоциируются с прогрессирующими опухолями [Zimmerman LE. , Armaly MF The nature of the orange pigment over a choroidal melanoma. Histochemical and electron microscopical observations. Arch Ophthalmol 1974 vol. 91, p. 359-61].

Сходство офтальмоскопической картины невуса хориоидеи и начальной увеальной меланомы дополняет сходные данные ультрасонографии или компьютерной томографии.

Из инструментальных методов исследования при проведении дифференциальной диагностики флюоресцентная ангиография является наиболее информативной. Основными ангиографическими признаками, характерными для начальной меланомы, является пятнистая гиперфлюоресценция, переходящая в венозной фазе в сливную; длительная остаточная флюоресценция опухоли. Как правило, начальную меланому хориоидеи окружает бордюр из флюоресцирующих друз, которые могут визуализироваться на поверхности всей опухоли, но в меньшем количестве, чем на периферии. Часто отмечаются изменения в регионарных сосудах, типа аневризм. Вокруг новообразования может быть реактивный гиперфлюоресцирующий ореол. Начальная меланома не имеет четких границ (фиг. 2). Вместе с тем, данные флюоресцентной ангиографии широко варьируют при невусах и маленьких опухолях. Они зависят от некоторых факторов, например степени васкуляризации меланомы или активности невуса. Обычно степень ранней гипофлюоресценции пропорциональная степени пигментации образования. Однако по мере заполнения сосудов флюоресцеином последний начинает пропотевать сквозь сосудистую стенку и гипофлюоресценция сменяется гиперфлюоресценцией различной степени выраженности в позднюю артериальную и венозную фазу. Таким образом, поздняя венозная фаза увеальной меланомы характеризуется сливной диффузной гиперфлюоресценцией. Однако аналогичная картина наблюдается и при прогрессирующем гигантском невусе или псевдотуморозных заболеваниях, метастатических опухолях хориоидеи, гемангиомах хориоидеи [Howard Schatz et al. "Interpretation of fundus fluorescein angiography". Sant Louis 1978].

Прогрессирующий невус с классической клинической картиной характеризуется на ангиограмме появлением на фоне гипофлюоресценции зоны пятнистого окрашивания; выявляются множественные хаотично разбросанные друзы, которые гуще и чаще располагаются от центра к периферии. Прогрессирующий невус также не имеет четких границ; вокруг зоны невуса, как и при начальной меланоме, могут быть и флюоресцирующий ореол и бордюр (фиг. 1). Некоторые авторы отмечают наличие микроаневризм сосудов сетчатки на его периферии. Раннее уменьшение флюоресценции зоны поражения считается более характерным для прогрессирующего невуса в отличие от начальной меланомы. Таким образом, практически одни и те же ангиографические признаки (мелкопятнистая гиперфлюоресценция на фоне признаков дистрофии сетчатки, чередование участков атрофии пигментного эпителия и его гиперплазии, друзы, микроаневризмы сосудов сетчатки, нечеткость контуров) могут иметь место и при начальной меланоме и при прогрессирующем невусе. Различия заключаются лишь в степени выраженности и сочетании различных симптомов, которые оцениваются субъективно. То есть на сегодняшний день нет патогномоничного симптома ни для невуса хориоидеи, ни для увеальной меланомы, выявляемых на флюоресцентной ангиографии. Практика показывает, что кроме "классических" случаев начальной меланомы хориоидеи и прогрессирующего невуса, когда диагностика на основе клиникоангиографической картины не представляет больших трудностей, у большинства пациентов имеет место "пограничная" клиническая и ангиографическая клиническая симптоматика, которая сложна для интерпретации, вследствие чего диагностика чрезвычайно затруднена. Кроме того, этот метод не всегда полезен в дифференциальной диагностике, например, в случаях локализации процесса на крайней периферии и невозможности достичь максимального мидриаза. Далее, флюоресцентная ангиография возможна только при абсолютно прозрачных оптических средах. У пациента не должны быть тяжелые соматические (сердечно-сосудистые, почечные) и аллергические заболевания. Указанные ограничения связаны с необходимостью введения флюоресцеина больному и возможностью возникновения аллергической реакции на препарат или способностью его вызывать изменения в коагулирующих свойствах крови с риском возникновения тромбоза вен нижних конечностей. Таким образом, возможности проведения флюоресцентной ангиографии ограничены у ряда пациентов.

В этом случае предпочтительна ультрасонография, поскольку проведение этого метода исследования не зависит от прозрачности оптических сред и возможно у всех пациентов, невзирая на тяжелый соматический статус.

Однако и при этом методе исследования нет четких патогномоничных признаков, свойственных только увеальной меланоме или только прогрессирующему невусу. При обеих нозологических единицах имеет место проминирующая "+ ткань" с определенными, относительно точными, характеристиками (уровень проминенции и диаметр основания). Точность измерения определяется разрешающими способностями оборудования, используемого при ультразвуковом сканировании. Форма опухоли или невуса может быть различной от "грибовидной" на тонком основании до почти плоской (что более характерно для метастазирующей опухоли сосудистой оболочки).

В подобных случаях решающим оказывается наблюдение в динамике (осмотр и повторение ФАГ и УЗИ через 3 месяца, сроки обусловлены скоростью роста подобных опухолей). Однако нельзя забывать о высоком риске метастазирования и значительной прогрессии опухоли за столь продолжительный срок наблюдения. Кроме того, в условиях тяжелой экономической инфляции повторные поездки для некоторых больных, проживающих в отдаленных регионах, связаны с значительными материальными затратами, порой неразрешимыми. В связи со всем вышеизложенным представляется чрезвычайно важным разработка новых методов дифференциальной диагностики, внедрение которых позволит не только поставить диагноз, но и своевременно и обоснованно начать органосохранное лечение, а следовательно, повысить эффективность проводимой терапии и увеличить продолжительность и качество жизни офтальмонкологических больных.

Проведение интраоперационной биопсии с проведением срочной гистологической верификации или P32-тестирование сопряжены с психологической, физической нагрузкой и операционной травмой и необходимостью принимать решение об объеме оперативного вмешательства на операционном столе, когда больной находится в бессознательном состоянии (наркозе). Но более важным на наш взгляд является ассоциация с высоким риском метастазирования в процессе забора биоптата или повреждением глазного яблока. Лишь отдельные авторы признают этот метод верификации диагноза.

За последнюю декаду в связи с появившимися публикациями о том, что в патогенезе увеальной меланомы огромное значение имеют иммунные механизмы, мы предположили, что какие-либо иммунологические показатели могут свидетельствовать о присутствии злокачественного неопластического процесса в организме уже на начальных стадиях.

В своей гипотезе мы отталкивались от того, что увеальная меланома является иммунозависимой опухолью [Char D.H. et al. Immunology of malanoma. Jap. J. Ophthalmol. - 1978-22-3 - p. 396-400]. Подтверждением иммуногенности является не только поведенческий характер опухоли, в виде возможных отсроченных метастазов спустя 30 лет после энуклеации или спонтанной регрессии первичного опухолевого узла [Scott R. et al. Spontaneous Regression of a Choroidal melanoma. Arch. Ophthalm. Vol 104, 1986, p. 732-734]. Иммунный ответ был подтвержден серией опубликованных экспериментальных и клинических работ. Так еще в 70-е годы выявлены изменения иммунной системы по типу повышенной чувствительности замедленного типа (РГЗТ), т.е. зафиксирована несомненная заинтересованность иммунологической реактивности организма [Priluck I.A. et al. Immune responsivness in patients with choroidal malignant melanom. Am. S. Ophthalmol - 1979 - vol 87 - p. 215-220].

Char с сотр., выявил у 5 из 7 больных с меланомой хориоидеи аномальное подавление миграции лейкоцитов методом РГЗТ [Char D.H. et al. Cutaneous delayed hypersensitivity reactions to soluble melanoma antigen in patients with ocular malignant melanoma. N. Eng. J. Med. - 1974 - 291 - p. 274-277]. Ранее ими же была описана положительная реакция кожи с растворенным меланомным антигеном у 18 из 19 пациентов с увеальной меланомой.

Аналогичные исследования функциональной активности иммуноцитов in vivo с использованием различных методик и митогенов проводили отечественные авторы (в реакции спонтанной бласттрансформации лимфоцитов) при увеальной меланоме. [Зайцева Н. С. с соавт. "Иммунологические и аллергические процессы в патологии органа зрения". Тез. У Всесоюзного съезда офтальмологов. - М., 1979 - т. 4. - с. 3-11; Нифонтова Т.П. Кожная реакция замедленной гиперчувствительности на 2-4 динитрохлорбензол у больных меланобластомой сосудистого тракта глаза. Офтальм. ж. - 1981 - N 6 - с. 356-357; Котелянский Э.О. с соавт. "Иммунологические исследования при увеальных меланомах". Сб. научн. работ: Офтальмоонкология - М. , 1983, - с. 68-72]. Обнаружены достоверные различия между показателями пациентов с развитой увеальной меланомой и донорскими. Обнаружена корреляция в 75% случаев исходного уровня с прогнозом и стадией увеальной меланомы.

Кожные тесты гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) остаются единственным способом оценки функций иммунокомпетентных клеток in vivo и при корректной интерпретации дают ценную информацию об иммунном статусе пациента с увеальной меланомой. Показатели ответа в кожных тестах РГЗТ коррелируют с результатами тестирования ГЗТ in vitro, включая оценку пролиферативного ответа лимфоцитов и определение продукции цитокинов. Кожные тесты ГЗТ являются наиболее простыми и эффективными методами оценки функций клеточного иммунитета у человека, однако их выполнение сопряжено с несколькими моментами.

Во-первых, необходима достаточно высокая профессиональная компетентность врача-иммунолога, чтобы идентифицировать саму реакцию ГЗТ, так как внутрикожная инъекция антигена может индуцировать несколько типов реакций у человека. При оценке ГЗТ решающими являются сроки появления пика реакции (24-48 часов) и характер ее проявления (покраснение и уплотнение), которые обусловлены накоплением лимфоцитов и макрофагов в месте введения антигена.

Во-вторых, отсутствие стандартных реагентов (антигена) требует для правильной интерпретации результатов предварительного тестирования на здоровых добровольцах с известной кожной реактивностью к интересующему антигену. В связи с этим гипоэргия (низкая реакция ГЗТ на антиген) может быть констатирована у больных только с более слабой реакцией, чем в группе здоровых доноров.

В-третьих, необходимо тестирование не на один, а хотя бы на два и более антигена, так как отсутствие или снижение реакции на какой-либо один антиген еще не является свидетельством анергии или гипоэргии у данного индивидуума, поскольку ему, возможно не приходилось ранее встречаться с этим антигеном, а ответ на другие антигены может быть сохранен.

Наиболее принятыми являются два метода кожных тестов РГЗТ:

1) классический метод заключается во внутрикожном введении 0,1 мл антигена (меланомного) с помощью тонкой иглы и шприца;

2) мультитест подразумевает стандартную технику использования пластикового аппликатора, когда с помощью щипчиков вводится семь антигенов и контролируется давление на коже. Используются несколько антигенов (антиген вируса паротита, дифтерийный токсин, туберкулин, и т.д.). По данным литературы, встречаемость положительного ответа на различный антиген у здоровых доноров различна и колеблется от 75,5% (на антиген паротита) до 38,3% - к дифтерийному токсину.

Однако, если вышеописанные реакции можно использовать при составлении прогноза конкретного больного с увеальной меланомой или определении эффективности проводимого лечения, то ни в одной из приведенных выше работ нет ссылок на то, что иммунологические показатели, полученные в реакциях ГЗТ, могут быть использованы в качестве маркеров злокачественной опухоли на начальном этапе при проведении дифференциальной диагностики сложных клинических случаев невусов хориоидеи и начальной меланомы сосудистой оболочки (болезнь и др.).

В поисках стандартных иммунологических приемов, используемых в диагностике неопластических процессов maligna на самых ранних его этапах, мы обнаружили способ определения иммунологических параметров естественных или нормальных киллерных клеток (НК) в различных биологических объектах (плевральном выпоте или крови).

НК присутствуют в периферической крови (до 15% от числа лимфоцитов) и в различных лимфоидных тканях человека. Выделенные из периферической крови человека они обладают in vitro спонтанной цитотоксической активностью против различных опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусами. Данная популяция лимфоцитов открыта в начале 70-х годов, и в результате ее интенсивного изучения общепринятым методом сформировалось мнение, что НК выполняют важнейшую функцию в организме, обеспечивая первый уровень защиты против опухолевых клеток и внутриклеточных инфекций до включения иммунных механизмов (Руководство по аллергологии и клинической иммунологии. - под ред. Хаитова Р.М., Львов, 1997, с. 23).

В отличие от других цитотоксических клеток (например T-супрессоров) НК опосредуют цитотоксические реакции без предварительной сенсибилизации и без рестрикции по экспрессии антигенов класса I и II главного комплекса гистосовместимости на клетках мишени, последние моменты обуславливают более быстрое реагирование этого клона на появление опухолевой клетки-мутанта. Высокая цитотоксичность и способность продуцировать многие цитокины - основные свойства естественных клеток киллеров, которые могут быть нарушены при злокачественных опухолях.

Kwong с соавт., проводя фенотипирование НК-клеток у больных с лимфомами установил, что выявление только CD56+ (метод фенотипирования) на нормальных киллерных клетках периферического русла у пациентов с множественной (полиорганной) лимфомой является неблагоприятным фактором при прогнозировании продолжительности жизни этих больных [Kwong-YL et al. "CD56+ NK lymphomas: clinicopathological features and prognosis". Br-J-Haematol. 1997 Jun; 97(4): 821-9].

Green-LK с соавт., определяя наряду с фенотипом относительный показатель (% содержание в пуле лимфоцитов) НК-клеток, выделяемых из плеврального выпота, использовал эти показатели в диагностике карциномы легких. Ему также удавалось в 90% анализируемых случаев прогнозировать вероятность метастазирования у пациентов [Green-LK; Griffin-J "Increased natural killer cells in fluids. A new, sensitive means of detecting carcinoma". Acta-Cytol. 1996 Nov-Dec; 40(6): 1240-5].

Ohlsson-Wilhelm-BM; Wang-G провели широкие исследования по выявлению количества циркулирующих НК-клеток в крови с одновременным определением их способности к цитолизу клеток-мишеней in vitro. Количественный показатель НК-клеток у пациентов с начальным раком молочной железы оказался не пригодным для этих целей, поскольку он практически не отличался от донорского. Индекс цитолиза определяли с использованием различных клеток мишеней (тест-панель включала К562, резистентные к НК-киллингу клетки Daudi и две опухолевые линии рака молочной железы, гормоно-чувствительную линию MCF7 и метастазирующую линию MDA-MB-435). Причем показатели цитолиза первых двух мишеней НК-клетками у пациентов с раком молочной железы и здоровых доноров не отличались. Вместе с тем, обнаружена достоверная разница в цитолитической активности НК пациентов с начальной стадией рака молочной железы и здоровых женщин при использовании клеток-мишеней MCF7 и MDA-MB-435. Цитолитическая активность увеличивалась по мере прогрессирования ракового процесса. Согласно представленным данным, больные с первой стадией рака молочной железы среди всех женщин с подозрительными мамограммами могут быть распознаны по повышенной функциональной способности их НК-клеток к цитолизу мишени MCF7. [Ohlsson-Wilhelm-BM; et al. Circulating killer cells in women undergoing needle-directed excisional breast biopsy. Eur-J-Histochem. 1994; 38 Suppl 1: 77-82}.

Напротив, у больных с метастазирующей формой аденокарциономы молочной железы или меланомой кожи функциональная активность киллеров ниже, чем у больных с начальными формами этих опухолей. Таким образом, установлена четкая корреляция между функциональной активностью естественных киллеров (как пула иммунокомпетентных клеток) и малигнизацией/метастазированием отдельных видов опухолей.

Аналогичных данных по изучению НК-клеток in vivo и in vitro при увеальной меланоме в доступной литературе нами не найдено. Пытаясь применить описанный выше способ (количественный подсчет и определение функциональной активности НК-клеток) при проведении дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы мы обнаружили, что наши данные отличаются от приведенных выше. Более того, выявлены достоверные отличия в полученных показателях двух анализируемых групп: увеальной меланомы и невусе хориоидеи.

Материалом для анализа послужили данные, полученные в процессе клинико-иммунологического обследования 12 пациентов с невусами хориоидеи и 57 человек с меланомой, в том числе 18 с начальной стадией увеальной меланомы различной локализации и размеров, не выходящих за пределы, обозначенные стадией T1N0M0 по международной классификации. Исследовали абсолютный показатель нормальных киллерных киллеров (CD16+) в периферической крови и функциональный свойства НК-клеток in vitro. Проведенные исследования контролировались данными инструментальных методов с целью подтверждения диагноза и исключения ошибки.

Полученные данные легли в основу излагаемого изобретения.

При анализе популяции CD16+ использовали абсолютный показатель, являющийся отражением количества клеток, циркулирующих в периферическом русле в единице объема, выражаемый в кл./мл3. Этот показатель в сочетании с удельной активностью достаточно полно отразил состояние НК популяции у пациентов с начальной меланомой.

Обнаружены достоверные отличия при оценке анализируемых показателей CD16+ в двух нозологических единицах. Так, если у пациентов с невусом хориоидеи абсолютный показатель не отличается от донорских, то при начальной увеальной меланоме отмечается достоверная гиперплазия пула CD16+ (ср. абсолютный показатель 600100 кл./мкл при норме 300100) с достоверным повышением удельной активности (при снижении, соответственно, цитолитической активности нормальных киллеров).

Таким образом, проведенные нами исследования позволили установить иммунологические параметры, характеризующие НК-клетки в условиях начальной увеальной меланомы.

Определяют субпопуляции НК-лимфоцитов с помощью особо чувствительного метода с применением моноклональных антител. Моноклональные антитела CD получают с помощью использования гибридомной технологии. Эти антитела способны с высокой точностью распознавать определенные клеточные компоненты иммунной системы. Антитела определенной специфичности связываются с флюоресцентной меткой /TC-флюоресцеин-изоцианат/. Обнаруживая на поверхности жизнеспособных клеток /лимфоцитов/ экспрессированные уникальные антигенные детерминанты, меченные флюоресцеином моноклональные антитела образуют соединения с этими детерминантами и делают клетки узнаваемыми и определяемыми количественно.

CD16+ являются природными эффекторными клетками и необходимы для эффективного иммунного ответа к опухоли. Они используют те же самые литические механизмы, что и цитотоксические T-лимфоциты (CD8+) для киллинга клеток, но при этом не экспрессируют T-клеточных антигенных рецепторов и осуществляют независимым от МНС способом киллинг клеток-мишеней. CD16+ могут лизировать как вирус-инфицированные, так и опухолевые клетки некоторых линий (К562), особенно гематопоэтических опухолей in vitro. Лизис таких линий очень показателен при оценке CD16+-активности. Он также зависит от степени специфичности киллинга, осуществляемого нормальными киллерами, поскольку многие вирус-инфицированные клетки и опухолевые клетки, как и большинство нормальных тканевых клеток in vitro, не чувствительны к нему. Основа этой специфичности не ясна. Мишенями CD16+ могут быть покрытые антителами опухолевые клетки.

Количественный подсчет CD16+ позволяет произвести оценку состояния иммунной системы конкретного больного. Учитывая роль иммунных эффекторных механизмов противораковой защиты вообще и киллерных клеток в частности, обнаружение реакций иммунного реагирования с участием CD16+клеток в организме у больного с подозрением на увеальную меланому позволяет предположить наличие процесса maligna.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего произвести дифференциальную диагностику начальной увеальной меланомы в клинически сложных, атипичных случаях. Техническим результатом является объективизация и повышение точности диагностики. Технический результат достигается за счет исследования CD16+ как фактора противоопухолевой защиты, принимающего участие от самых ранних этапов неопластического процесса до стадии метастазирования.

Способ осуществляли следующим образом.

Определение уровня субпопуляций CD16 проводили с помощью метода моноклональных антител [Frank C. Hay, Leslie Hudson "Practical Immunology. 1987 Blackwell Scientific Publications].

1. Забирают периферическую кровь в объеме 5 мл из локтевой вены в пробирку, содержащую ЭДТА.

2. Производят маркировку пробирок (количество последних на одного больного равно числу определяемых типов субпопуляций плюс одна контрольная).

3. В пробирку, содержащую 100 мкл хорошо перемешанной цельной крови вносят 100 мкл PBS (фосфатный буферный раствор, приготовленный согласно официнальной прописи) и помещают пробирку в ледяную баню.

4. В каждую пробирку вносят 7 мкл соответствующего типа моноклональных антител, растворенных в дистиллированной воде предварительно, в соответствии с инструкцией.

5. Затем, в течение 15-30 секунд осторожно встряхивая пробирки, смешивают компоненты. Манипуляцию повторяют пять раз с минутным интервалом.

6. Пробирки изымают из ледяной бани, добавляют в каждую из них 2 мл лизирующего раствора, который представляет собой один из компонентов коммерческого набора. Его готовят накануне согласно инструкции, данной фирмой-поставщиком оборудования. Пробирки помещают в шейкер после каждого добавления.

7. Производят инкубацию исследуемых образцов при комнатной температуре в течение 5-10 минут до получения прозрачного "лакового" раствора.

8. Пробирки центрифугируют в течение 5 минут при 400 X оборотах в минуту и удаляют супернатант из каждой пробирки. При недостаточном эффекте клетки отмывают до 7-8 раз.

9. Пробирки помещают в ледяную баню.

10. Количественное измерение субпопуляций производят на лазерном цитофлуориметре "Спектрум-3" фирмы "Орто Диагностик Системс", США.

11. Получают показатели CD16.

Активность НК-клеток определяют в цитотоксическом тесте по лизису меченных радиоизотопными изотопами клеток-мишеней (КМ), которыми служат опухолевые линии клеток К-562 (миелолейкоз человека). В качестве тестируемых клеток-эффектов используют мононуклеары периферической крови.

Реакцию осуществляют следующим способом:

1. Взвесь клеток периферических мононуклеаров разводят до концентрации 1107 в 1 мл.

2. Клетки мишени К562 (3-дневного культивирования) метят 3H-уридином в дозе 3 мкКи на 1 мл клеточной культуры. Для этого клеточную взвесь в концентрации 5105 в 3 мл культуральной среды инкубируют с изотопом (удельная активность 24 Ки/мМ) 1 час при 37oC, трижды отмывают средой Игла, содержащей 10% бычьей сыворотки и антибиотики, и центрифугируют при 400g при 20oC 10 минут. Отмытые клетки-мишени выдерживают в культуральной среде 2 часа при 37oC и еще раз отмывают с целью удаления дериватов 3H-уридина, не включавшегося в РНК-клеток-мишеней. После этого готовят рабочую взвесь меченых КМ, которая содержит в 1 мл 1106 КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы (Гедеон-Рихтер, Венгрия).

3. Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей взвеси и меченых КМ (т. е. 1104 клеток) и 100 мкл суспензии мононуклеаров, которую разводят так, чтобы выдерживалось соотношение КЭ:КМ = 100:1, 50:1, 25:1, 12:1. Каждое разведение КЭ помещают в три ячейки. Контрольными пробами являются эти же меченые КМ, которые помещают в ячейки без добавления КЭ.

4. Заполненный планшет инкубируют 14-16 часов во влажной атмосфере при 37oC в CO2-инкубаторе. После инкубации содержимое ячеек переносят на мембранные фильтры с диаметром пор 2,5 мкм и отмывают как описано выше.

Анализируемый параметр выражен как удельная киллерная активность, отражающая количество эффекторных клеток, необходимых для лизиса одной клетки-мишени с учетом литического потенциала единичного киллера. В норме у здоровых доноров удельная активность нормальных киллеров колеблется в пределах 7-12 усл. единиц.

Оценка результатов

Функциональную активность НК оценивают по разнице радиоактивности, выделяемой на -сцинтилляционном счетчике в ячейках, содержащих или не содержащих клеток-эффекторов. Индекс цитотоксически определяют по формуле:



При выявлении повышенного абсолютного показателя CD16+ с повышенной удельной активностью у пациента с подозрением на увеальную меланому диагностируют увеальную меланому в стадии T1N0M0. Ему следует срочно назначить адекватную терапию в виде существующих современных методов фото- и лазеркоагуляции, брахитерапии или термотерапии. А при отсутствии отклонений в исследуемых показателях констатируют прогрессирующий невус и оставляют такого больного под наблюдением окулиста.

Пример 1.

Больная К, 36 лет. На профилактическом осмотре у окулиста случайно обнаружили на правом глазу сероватое проминирующее образование в верхненаружном квандранте глазного дна в 4 ПД от Диска Зрительно Нерва с соответствующим дефектом в поле зрения. Острота зрения на правом глазу = 1,0. Ультразвуковое исследование подтвердило наличие "+ткани" с проминенцией 2,1 мм и диаметром основания 9 мм2. Ангиографическая картина, динамика развития ангиографических признаков могла быть характерной и для начальной увеальной меланомы и для невуса хориоидеи, так как имело место раннее вымывание флюоресцеина. Проведено иммунологическое исследование. Выявлена гиперплазия пула CD16+ с абсолютным показателем 538 кл./мкл (при норме до 400 кл./мкл). Функциональные показатели клеток также отличались от донорских. Удельная активность CD16+ повышена до 16 усл. ед. (при норме от 7 до 12 усл.ед.). Основываясь на картине флюоресцентной ангиографии, клинико-анамнестических, инструментальных и иммунологических данных, пациентке был поставлен диагноз начальной меланомы. Была предложена брахитерапия с одномоментным 32P тестирование на операционном столе для подтверждения диагноза и обоснования тактики лечения. Радиоиндикаторный теста дал положительный результат. Счет РФИ выявил асимметрию накопления 32P в месте предполагаемой злокачественной опухоли и симметричном месте на 200%, что подтвердило диагноз увеальной меланомы и обосновывало необходимость проведения брахитерапии (как одного из возможных методов лечения). На осмотре через 2 года: сформировался плотный хориоретинальный рубец, соответствующий зоне облучения, определяемый на УЗИ.

Пример 2. Больной В., 23 года. После контузионной травмы головы попал в стационар, где случайно отметил снижение зрения на левый глаз с дефектом в поле зрения. Был осмотрен окулистом. Выявлено проминирующее пигментированное образование в парамакулярной зоне. При проведении компьютерной периметрии относительные и абсолютные скотомы в соответствующей половине поля зрения. Острота зрения 0,7, не корригирует очковыми линзами. УЗИ выявило проминирующую "+ткань+ с высотой 3,0 мм и диаметром 10 мм2. Характер накопления флюоресцеина в зоне предполагаемой опухоли не соответствовал увеальной меланоме. Иммунологическое обследование выявило увеличение абсолютного показателя CD16+ до 600 кл./мкл. Обнаружено повышение удельной активности до 17 (соответственно, литическая их активность снижена). Установлен диагноз меланомы хориоидеи левого глаза. Предложена брахитерапия. однако для подтверждения диагноза больной был "заряжен" 32P. Радиофосфорная индикация подтвердила диагноз и необходимость брахитерапии, которая и была проведена. Спустя год, на осмотре: отмечена полная регрессия опухолевого узла с формированием плоского хориоретинального узла.

Пример 3. Больная 54 лет. Обратилась к окулисту с жалобами на появление пятна в поле зрения правого зрения. Заметила случайно, после того как рукой закрыла парный здоровый газ. Острота зрения на правом глазу = 0,4, не корригирует, на левом = 1,0. Ранее, на протяжении 10 лет к окулистам не обращалась. Ничего не может сказать о зрительных функциях обоих глаз при более ранних проверках. При офтальмоскопии выявлено аспидного цвета проминирующее образование с мелкими участками оранжевого пигмента и друзами на периферии образования. Расположено в макулярной зоне, УЗИ подтвердило наличие "+ткани" с высотой 1,9 мм и диаметром 8 мм2. ФАГ провести не представлялось возможным в связи с имеющимися противопоказаниями у больной (тромбоз глубоких вен голени). Иммунологическое обследование не выявило никаких отклонений от нормы. Больная отпущена под наблюдение окулиста по месту жительства. Предложен контроль через 6 месяцев. На последующей явке. Данные периметрии, УЗ-исследования, офтальмоскопии оказались на прежнем уровне. Повторное иммунологическое исследование не выявило отклонений от нормы по-прежнему. Вновь отпущена на срок 6 месяцев. При третьей явке состояние стабильно. Все показатели на прежнем уровне. Диагноз установлен: прогрессирующий невус хориоидеи с дистрофическим компонентом.

Таким образом, полученные нами данные с анализом клиники заболевания на протяжении продолжительного периода (до 2-х лет) у больных с невусами хориоидеи и начальными увеальными меланомами позволяют утверждать, что с помощью предложенных иммунологических исследований возможно ранее выявление увеальной меланомы, проведение дифференциальной диагностики между указанными двумя нозологическими единицами.

Практическая ценность предлагаемого нами способа заключается в том, что он позволяет осуществить дифференциальную диагностику в клинически сложных и атипичных случаях, что дает возможность своевременно и более эффективно провести адекватное лечение с целью удлинения продолжительности жизни офтальмоонкологических больных. Метод достаточно информативен, малотрудоемок при большой практической ценности. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ дифференциальной диагностики начальной увеальной меланомы от прогрессирующего невуса хориоидеи, включающий исследование иммуннокомпетентных клеток в сыворотке периферической крови, отличающийся тем, что диагностику проводят по абсолютному показателю популяции нормальных киллерных клеток СД16+ и их удельной активности и при их одновременном повышении за пределы нормы констатируют начальную увеальную меланому, а при отсутствии изменений в показателях - прогрессирующий невус хориоидеи.