СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛЕЙКОПОЭЗА

СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛЕЙКОПОЭЗА


RU (11) 2078581 (13) C1

(51) 6 A61K38/16, A61K35/60 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.05.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 93046329/14 
(22) Дата подачи заявки: 1993.10.11 
(45) Опубликовано: 1997.05.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. Соболева Э.П. Применение ДНК при цитопении, вызванной миелосаном. Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 1976, т.81, N 4, с.409 - 411. 
(71) Имя заявителя: Научно-производственное предприятие "Фармэк" 
(72) Имя изобретателя: Трещалин И.Д.; Бодягин Д.А.; Переверзева Э.Р.; Сыркин А.Б.; Асафов А.В.; Безюлев В.В.; Трещалина Е.М. 
(73) Имя патентообладателя: Научно-производственное предприятие "Фармэк" 

(54) СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛЕЙКОПОЭЗА 

Использование: в области медицины и, в частности, в онкологии и может применяться при миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией. Сущность изобретения: осуществляют однократное подкожное введение экзогенной ДНК, полученной из молок осетровых рыб, в виде порошка низкополимерной, содержащей не менее 80% нативной натриевой соли ДНК с молекулярной массой 270 - 500103Д при мольных соотношениях нуклеотидов: аденин - 29.0, тимин - 27.0, гуанин - 22,0, цитозин - 20.0. Способ не вызывает осложнений и одновременно стимулирует костномозговое кроветворение. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине и в частности, к онкологии и может быть использовано для стимуляции лейкопоэза при миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией.

Известно, что цитостатическая терапия, составляющая основу лекарственного лечения при опухолях, вызывает угнетение гемопоэза даже в терапевтических дозах /5/. При этом токсическая миелодепрессия регистрируется в периферической крови как лейкопения, тромбоцитопения и далее анемия /2/. Предупреждение этого осложнения осуществляется за счет коррекции доз цитостатиков и назначения средств, стимулирующих лейкопоэз. Известно использование с этой целью спленина, лейкогена, пентоксила, зимозана, витаминов различных групп /3/. В процессе поиска новых биологически активных материалов было выявлено лейкостимулирующее действие нуклеиновых кислот /1, 4/. Так известен способ стимуляции лейкопоэза, включающий введение препарата гомологичной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), полученной из тимуса и селезенки крыс /6/. Однако этот способ обладает рядом недостатков, наиболее существенными из них являются медленное развитие лейкоцитарной реакции и отсутствие стимуляции костно-мозгового кроветворения.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в рамках заявленного способа стимуляцию лейкопоэза осуществляют за счет натриевой соли ДНК, полученной из молок осетровых рыб, при этом введение препарата проводят одно-, трех- или пятикратно подкожно в эквитерапевтических дозах.

Существенными признаками предложения следует считать использование натриевой соли ДНК, полученной из молок осетровых рыб, ранее по данным показаниям не применявшейся, а также разработку режимов введения препарата.

Для получения натриевой соли ДНК проводят гомогенизацию молок осетра в водном растворе натрия хлорида и натрия цитрата, промывание материала, смешивание с детергентом, отделение и обогащение жидкой фракции, отмывание в пермеате, выделение очищенного биоактивного материала.

Соль ДНК, полученная в результате описанного процесса, имеет следующие свойства. Это белый порошок, содержащий не менее 80% по весу натриевой соли нативной, низкомолекулярной, низкополимерной ДНК, полученной из молок осетра, не более 1% по весу белков, не более 17% по весу влаги, остальное натрия хлорид.

ДНК, полученная из молок осетра, имеет следующий состав нуклеотидов:

Нуклеотид Мольный продукт

аденин 29,0

тимин 27,0

гуанин 22,0

цитозин 20,0

Натриевая соль ДНК имеет молекулярный вес 270 500103 дальтон и гиперхромный эффект не менее 37%

Для раскрытия сущности изобретения ниже приведены результаты экспериментальных исследований по стимуляции лейкопоэза препаратом ДНК в условиях лейкоцитопении, вызванной цитостатиками.

В первой серии экспериментов исследования проведены на собаках породы "английский бигль" весом 11,5 15,6 кг. Аплазию кроветворной ткани вызывали пероральным введением миелосана в дозе 15 мг/кг однократно на сутки "0" опыта. Натриевую соль ДНК вводили подкожно в разовых дозах 10 мг/кг и 25 мг/кг двукратно на 3 и 7 сутки после введения миелосана. Суммарные дозы ДНК составили, соответственно, 20 мг/кг и 50 мг/кг. Собаки контрольной группы получали по 10 мл физиологического раствора подкожно в те же сроки. На 3, 7, 14, 21, 28, 42 и 49 сутки опыта определяли количество лейкоцитов в периферической крови и содержание кариоцитов костного мозга в стернальных пунктатах.

Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Как видно из представленных результатов, введение миелосана вызвало резкое падение содержания лейкоцитов в периферической крови и кариоцитов в костном мозге. В контрольной группе содержание лейкоцитов и кариоцитов у животных оставалось низким до 28 суток опыта и начинало постепенно восстанавливаться, начиная с 42 суток, однако до конца наблюдения на 49 сутки не достигало исходного уровня.

Введение натриевой соли ДНК существенно меняло картину токсического действия цитостатика и способствовало более быстрому восстановлению содержания костномозговых клеток и лейкоцитов. Так, в обеих группах при введении натриевой соли ДНК в суммарных дозах 20 и 50 мг/кг наблюдалась менее глубокая лейкоцитопения.

Тенденция к восстановлению количества лейкоцитов периферической крови отмечалось уже с 21 суток опыта, а к концу наблюдения уровень лейкоцитов практически достигал исходного. Аналогичная картина наблюдалась и в восстановлении содержания кариоцитов костного мозга.

Таким образом, в данной серии экспериментов на собаках было показано, что натриевая соль ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг и наиболее отчетливо в дозе 50 мг/кг способствует ускоренному восстановлению показателей кроветворения при угнетении гемопоэза, вызванном цитостатиком миелосаном.

Вторая серия экспериментов была проведена на мышах гибридах F1(CBAXC57Bl) самцах массой 18 20 г. Цитопению вызывали путем введения циклофосфана внутрибрюшинно однократно в дозах 200 и 275 мг/кг. Натриевую соль ДНК вводили подкожно однократно в дозах 150 и 30 мг/кг, а также на 3, 5, 7 сутки после введения циклофосфана. На 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 21 и 25 сутки определяли общее количество лейкоцитов в периферической крови с использованием камеры Горяева. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Как видно из результатов, представленных в таблице 2, максимальный цитопенический эффект при введении циклофосфана развивается к 3 суткам, восстановление количества клеток отмечается к 7 9 суткам. Однако на 12 13 сутки наблюдается второе, менее глубокое снижение количества лейкоцитов. При введении ДНК в дозе 150 мк/кг на 3, 5 и 7 сутки достигается максимальный стимулирующий эффект. Причем через 2 3 дня после первой инъекции ДНК количество клеток возвращается к фоновому уровню до введения миелосана, а к 7 10 суткам количество клеток достигает максимальной величины, превышающей этот уровень. Важно отметить, что в отличие от других гемокорректоров, ДНК не вызывает компенсаторного падения количества клеток после гемостимуляции.

В целом анализ экспериментальных материалов позволяет сделать следующие выводы: 1. в отличие от прототипа при использовании заявленного способа осуществляется быстрое восстановление количества лейкоцитов в периферической крови и увеличение количества кариоцитов в костном мозге; 2. для получения стимулирующего эффекта достаточно одной инъекции препарата ДНК. Наилучший эффект достигается при трех- или пятикратном применении препарата с интервалом 48 часов; 3. заявленный способ в отличие от прототипа не вызывает компенсаторного уменьшения количества клеток после гемостимуляции; 4. при использовании способа не выявлено побочных явлений и осложнений.

Пример N1. Эксперимент проведен на 9 собаках породы "Английский бигль" (6 самцов и 3 самки) массой 11,5 15,6 кг. Аплазию кроветворной ткани вызывали пероральным введением миелосана в дозе 15 мг/кг однократно. Натриевую соль ДНК вводили подкожно двукратно на 3 и 7 сутки в разовых дозах 10 мг/кг и 25 мг/кг после введения миелосана. Суммарные курсовые дозы ДНК составили 20 мг/кг и 50 мг/кг. Животные контрольной группы получали по 10 мл физиологического раствора подкожно в те же сроки. Количество лейкоцитов (в тыс. на 1 мм3 крови) по дням исследования у одного экспериментального животного составили: при введении ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг на 3 день 11,2; на 7 день 5,9; на 14 день 3,9; на 21 день 3,1; на 28 день 3,9; на 42 день 6,9; на 49 день 9,9; при введении ДНК в суммарной дозе 50 мг/кг на 3 день 9,6; на 7 день 6,9; на 14 день 4,3; на 21 день 4,5; на 28 день 5,95; на 42 день 8,95; на 49 день 10,95.

Количество кариоцитов в стернальном пунктате (в тыс. на мм3 пунктата) у одного экспериментального животного составили: при введении ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг на 3 день 51,0; на 7 день 7,2; на 14 день 10,8; на 21 день 12,9; на 28 день 13,3; на 42 день 25,5; на 49 день 32,1; при введении ДНК в суммарной дозе 50 мг/кг на 3 день 48,5; на 7 день 11,2; на 14 день 12,3; на 21 день 13,7; на 42 день 27,4; на 49 день 44,7.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует восстановление количества лейкоцитов в периферической крови и клеток костного мозга при введении натриевой соли ДНК в заявленном режиме.

Пример N2. Эксперимент проведен на 50 мышах гибридах F1(CBAXC57Bl6), самцах массой 18 20 г. Цитопению вызывали путем введения циклофосфана внутрибрюшинно однократно в дозе 200 мг/кг. Натриевую соль ДНК вводили в двух схемах: однократно в дозах 30 и 150 мг/кг через 3 суток после цитостатика и 3-х кратно с интервалом 48 часов в разовой дозе 150 мг/кг, начиная с 3 суток после цитостатика. Суммарная доза в последнем случае составила 450 мг/кг.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует стимуляцию лейкопоэза при введении натриевой соли ДНК на модели цитопении, полученной под действием цитостатиков.

Сравнение результатов проведенных исследований с литературными данными по изучаемому вопросу позволило охарактеризовать заявленный способ следующим образом (см. табл. 3).

В целом следует отметить, что заявленный способ по сравнению с известными по уровню техники обладает следующими преимуществами: 1. при использовании способа осуществляется не только быстрое восстановление количества лейкоцитов в периферийной крови, но и увеличение количества кариоцитов костного мозга, что практически не встречается у аналогов и прототипа; 2. в отличие от других препаратов ДНК, способ не вызывает мутагенных изменений в организме; 3. способ не вызывает компенсаторного падения количества клеток после гемостимуляции.

Таким образом, заявленный способ значительно расширяет арсенал методов коррекции лейкопоэза при лейкоцитопении, вызванной цитостатиками и, по-видимому, найдет широкое применение не только в онкологии, но и радиационной медицине, медицине экстремальных состояний. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ стимуляции лейкопоэза, включающий введение ДНК, отличающийся тем, что в качестве ДНК используют экзогенную ДНК, полученную из молок осетровых рыб, в виде порошка низкополимерной, содержащей не менее 80% нативной натриевой соли, ДНК с молекулярной массой 270 500103Д, при мольных соотношениях нуклеотидов аденин 29,0, тимин 27,0, гуанин 22,0, цитозин 20,0, а введение препарата осуществляют однократно, 2 3 раза через 48 ч или 5 раз через 24 ч подкожно в эквитерапевтических дозах.