ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОК НОВООБРАЗОВАНИЙ (НЕОПЛАЗИИ)

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОК НОВООБРАЗОВАНИЙ (НЕОПЛАЗИИ)


RU (11) 2162101 (13) C1

(51) 7 C12N5/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2001.01.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 99112808/13 
(22) Дата подачи заявки: 1999.06.10 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.06.10 
(45) Опубликовано: 2001.01.20 
(56) Аналоги изобретения: Sakakibara T. et.al., Cancer Research, v.56, p.3743-3746, 1996. WO 93/24647 A1, 09.12.1997. WO 95/24484 A1, 14.09.1995. Якубов А.С., Эльберт И.А. Бюлл. СО АМН СССР, 1989, N1, с.45-48. 
(71) Имя заявителя: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 
(72) Имя изобретателя: Гаенко Г.П.; Водовозова Е.Л.; Молотковский Ю.Г. 
(73) Имя патентообладателя: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 
(98) Адрес для переписки: 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая 16/10, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 

(54) ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОК НОВООБРАЗОВАНИЙ (НЕОПЛАЗИИ) 

Изобретение относится к биотехнологии, экспериментальной онкологии и клеточной биологии и может быть использовано для сравнительного изучения клеток опухоли и метастаза одного вида рака. Тест-система для изучения различных клеток новообразований представляет собой линии перевиваемых клеток, выделенных из тканей новообразований и состоит из двух линий перевиваемых клеток, выделенных из тканей опухоли и метастаза карциномы легкого Льюис. Изобретение позволяет изучать противораковую активность и проводить скрининг лекарственных средств. 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области биотехнологии, экспериментальной онкологии, клеточной биологии и может быть использовано для сравнительного изучения свойств клеток опухоли и метастаза одного вида рака, а также для изучения противораковой активности новых лекарственных средств,

Твердые опухоли, особенно опухоли легкого, содержат различные популяции клеток, что усложняет диагностику и лечение рака. Имеющееся в настоящее время незначительное число моделей ограничивает исследование in vitro.

Проблема создания тес-системы для сравнительного изучения in vitro и in vivo физиологических и биохимических свойств клеток опухоли и метастаза карциномы легкого Льюис, а также для изучения биологической активности новых лекарственных средств является актуальной.

Известна тест-система (Herrmann D.B. et. al. Antitumor activity of ilmofosine in the Lewis-Lung carcinoma model, Lipids, v. 26, 12, 1991). Для получения клеток карциномы легкого Льюис проводили серию перевивок внутримышечно опухоли. Затем опухоль иссекали. Механическим и ферментативным способом получали суспензию клеток, пригодную для трансплантации.

Указанная тест-система не может быть использована для изучения клеток метастаза. Эта система не является устойчивой перевиваемой линией клеток.

Известна более близкая к заявленной тест-система. Опухоль карциномы легкого иссекают, измельчают на мелкие куски. Измельченную ткань помещают в раствор ферментов: коллагеназы, ДНКазы и гиалуронидазы. Затем клетки отмывают и помещают в питательную среду, используя подложку из Matrygel. Линия клеток TL-1 прошла 100 пассажей и использовалась для исследования экспрессии клеточных адгезивных молекул, туморогенной активности и метастатического потенциала в SD-мышах. (Sakakibara T. , et al. Doxorubicin encapsulated in sterically stabilized liposomes is superior to free drug or drug-containing conventional liposomes at suppressing growth and metastases of human lung tumor Xenografts. Cancer Researsh 56, 15, 3743-3746, 1996). Эта тест-система также не может быть использована для сравнительного изучения клеток опухоли и метастаза.

Изобретение решает задачу создания тест-системы для изучения физиологических, биохимических различий клеток опухоли и метастаза карциномы легкого Льюис.

Поставленная задача решается за счет того, что тест-система для изучения различий клеток неоплазии (или новообразований), представляющая собой перевиваемые линии клеток, выделенных из тканей новообразований, состоит из двух линий перевиваемых клеток, выделенных из тканей опухоли и метастаза карциномы легкого Льюис.

Предлагаемая тест-система отличается тем, что представляет собой линии клеток опухоли и метастаза карциномы легкого Льюис, полученных без помощи ферментов и культивируемых на обычных подложках. Обе линии прошли около двухсот пассажей и сохраняют туморогенность. Обе линии клеток депонированы во Всероссийской коллекции клеточных культур 12.01.1999 года под номерами ВСКК(П) N 652-Д и ВСКК(П) N 653-Д соответственно.

Опухоль карциномы легкого Льюис возникла спонтанно и зарегестрирована в США 1951 году.

Тест-систему получают следующим образом. Иссекают опухоль и несколько метастазов. Отмывают в физрастворе, измельчают и помещают в раствор Версена (R. I. Freshney. Culture of animal cells. A manual of basic technique. New York. 1983). Затем клетки отмывают и помещают в питательную среду.

Морфологические и культуральные свойства. Клетки культивируют на среде RPMI-1610 с добавлением 7% сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глютамина, в атмосфере 5% CO2. Клетки субстратзависимые, могут образовывать сфероиды, обладают устойчивой туморогенностью.

Контаминация. Контаминантов не обнаружено.

Криоконсервация. Клетки снимают с подложки с помощью раствора Версена. Осаждают при 800 об/мин. Готовят суспензию в питательной среде 106 кл/0,5 мл, пипетируют и переносят в ампулу для криоконсервации. Вносят 0,5 мл раствора 20% ДМСО в сыворотке и помещают на -70oC. Через 10-14 дней переносят на -160oC.

Условия разморозки. Стандартные.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Отмытые от среды культивирования клетки суспендируют в фосфатном буфере. Каплю суспензии (106 кл/мл) наносят на предметное стекло. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют в парах 10% формальдегида 3 минуты. Отмывают дистиллированной водой. Высушивают на воздухе. На фиксированные клетки наносят растворы углеводных векторов-флуоресцеинмеченых гликоконъюгатов на полиакриламидной матрице (50-60 мкл, Sug-PAA-Fl, 0,3 мг/мл) и инкубируют 1 час при 37oC. Отмывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Связывание клеток с вектором оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа (495 nm, 530 nm). Результаты, полученные по определению лиганд-рецепторного связывания 25 углеводных векторов с поверхностью клеток опухоли и метастаза, выявили существенные различия среди адгезивных рецепторов обоих видов клеток (табл. 1)

Пример 2. Клетки отмывают от среды культивирования, суспендируют в фосфатном буфере, к 1 мл суспензии клеток добавляют 100 мкл флуоресцеинмеченых углеводных векторов (Sug-PAA-Fl), лиганд-рецепторное связывание определяют количественно с помощью проточной цитометрии. Результаты показали, что связывание, определяемое по среднестатическому значению флюоресценции одной клетки (mean), зонда SiaLex с клеткой опухоли составляет 3,45, а с клеткой метастаза - 7,45, связывание вектора Lex с клеткой опухоли - 14,4, с клеткой метастаза - 6,89.

Пример 3. Для доставки лекарственных средств к клеткам новообразований предлагаются липосомы, оснащенные углеводным вектором, обеспечивающим специфическое связывание липосом с клеточными лектинами. Клетки снимают с подложки с помощью раствора Версена, отмывают от культуральной среды. В 1 мл, суспензии клеток в физиологическом растворе (106 кл/мл) вносят 100 мкл препарата флуоресцентномеченных липосом (препарата N 1 и препарата таких же липосом с углеводным вектором Lex (препарат N 2). С помощью проточной цитомстрии измеряют динамику связывания в течение 15 минут клеток опухоли и метастаза. В табл. 2 даны среднестатические значения флюоресценции одной клетки-mean. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Тест-система для изучения клеток новообразований (неоплазии), представляющая собой линии перевиваемых клеток, полученных из тканей новообразований, отличающаяся тем, что тест-система состоит из двух линий клеток : опухоли ВСКК (П) 652-D и метастаза ВСКК (П) 653-D карциномы легкого Льюис.