СПОСОБ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИНТЕРФЕРОНУ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ

СПОСОБ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИНТЕРФЕРОНУ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ


RU (11) 2293988 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/50 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005100610/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.01.11 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.01.11 
(43) Дата публикации заявки: 2005.09.10 
(45) Опубликовано: 2007.02.20 
(56) Аналоги изобретения: US 5145773, 08.09.1992. RU 2003334 C1, 30.11.1993. RU 2216739 C2, 20.11.2003. RU 2181889 C1, 27.04.2002. RU 2175769 С2, 10.11.2001. RU 98105888 А, 20.02.2000. 
(72) Имя изобретателя: Куртасова Людмила Михайловна (RU); Шкапова Екатерина Алексеевна (RU); Савченко Андрей Анатольевич (RU); Крыжановский Альберт Иванович (RU); Зуков Руслан Александрович (RU); Рачкова Наталья Владимировна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: ГУ Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН (RU); Красноярский краевой онкологический диспансер (RU) 
(98) Адрес для переписки: 660022, г.Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Г, НИИ медицинских проблем Севера, А.А. Савченко 

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИНТЕРФЕРОНУ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и онкологии, может быть использовано при лечении больных раком почки. Чувствительность к интерферону у больных раком почки оценивают путем исследования крови пациента in vitro с помощью хемилюминесцентного анализа по индексу чувствительности (ИЧ). ИЧ представляет собой отношение индекса активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (ИАIFN) к индексу активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона (ИА). ИА IFN представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNинд) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNспон). ИА представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов (Sинд) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов (Sспон). О чувствительности к интерферону судят по отклонению ИЧ от 1,0. ИЧ, превышающий 1,0, свидетельствует о чувствительности к интерферону, а ИЧ, меньший или равный 1,0, свидетельствует об отсутствии чувствительности к интерферону. Изобретение обеспечивает повышенную эффективность интерферонотерапии у больных раком почки за счет повышения точности, сокращения времени исследования, снижения стоимости и упрощения способа.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и онкологии. Может быть использовано при лечении больных раком почки.

Известен способ определения чувствительности к интерферонотерапии при раке почек путем использования моноклональных антител для формирования комплекса антиген-антитело на поверхности опухолевых клеток (US 5145773). Объектом исследований являются замороженные клетки или ткани почечной карциномы. Чувствительность к интерферону определяется по уровню экспрессии gp 160, который выявляется моноклональными антителами, например F33 (АТСС № HB 10156). Снижение экспрессии gp 160 на клетках рака почки свидетельствует о прогнозируемом положительном эффекте интерферонотерапии.

Известный способ является достаточно информативным, поскольку определение чувствительности к интерферону осуществляется по уровню онкомаркера, характерного именно для карциномы почки. Однако в известном способе оценивается воздействие интерферона только на опухолевые клетки (антипролиферативный, цитотоксический эффект), но не рассматривается воздействие интерферона на клетки иммунной системы пациентов (иммуномодулирующий эффект). То есть данный способ не предназначен для профилактики возникновения метастазов после радикальной нефрэктомии. Кроме того, к недостаткам известного способа относятся его высокая стоимость, необходимость наличия стерильного бокса (для культивирования клеточных культур), длительность и сложность выполнения.

Задачей изобретения является повышение эффективности интерферонотерапии у больных раком почки.

Задача решается тем, что в способе оценки чувствительности к интерферону у больных раком почки, заключающемся в биологическом исследовании терапевтической активности интерферона, согласно изобретению при исследовании крови пациента in vitro осуществляют хемилюминесцентный анализ функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. После чего определяют индекс чувствительности (ИЧ), представляющий собой отношение индекса активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (ИАIFN ) к индексу активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона (ИА).

Т.е.: ИЧ=ИАIFN/ИА

Индекс активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (ИАIFN) представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNинд) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNспон ). Индекс активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона (ИА) представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов (Sинд ) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов (Sспон).

Т.е.: ИА IFN=SIFNинд/SIFNспон ; ИА=Sинд/Sспон

О чувствительности к интерферону судят по отклонению ИЧ от 1,0. ИЧ, превышающий 1,0, свидетельствует о чувствительности к интерферону, а ИЧ, меньший или равный 1,0, свидетельствует об отсутствии чувствительности к интерферону.

Высокая реактивность нейтрофильных гранулоцитов, их способность к быстрой функциональной перестройке в ответ на воздействие агентов различной природы позволяет рассматривать эти клетки как индикатор нарушений иммунного гомеостаза. Кроме того, после активации нейтрофильные гранулоциты сами становятся мощными эффекторами каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления и проявление цитотоксической активности данной клеточной популяции, в частности к опухолевым клеткам. Помимо этого нейтрофильные гранулоциты несут на своей поверхности специфические рецепторы к интерферону, что делает возможным оценивать влияние интерферона на эти клетки в экспериментах in vitro.

Индекс активации является показателем соотношения интегральных характеристик синтеза активных форм кислорода в измеряемом диапазоне времени, полученных от стимулированных клеток, и клеток, находящихся в состоянии покоя.

Индекс чувствительности выше 1,0, характеризует положительную функциональную реакцию нейтрофильных гранулоцитов на интерферон. Индекс чувствительности равен 1,0 в тех случаях, когда реакция клеток на интерферон отсутствует. Индекс чувствительности ниже 1,0 определяется ингибирующим воздействием интерферона на клетку, сопровождается развитием отрицательной функциональной реакции.

Способ выполняют следующим образом. Из венозной крови обследуемого больного, выделяют нейтрофильные гранулоциты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляют 1 мл полиглюкина. Смесь инкубируют в течение 30 мин при 37°С для ускорения осаждения эритроцитов. Полученный лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл Хенкса и получают взвесь. Подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева. Проводят хемилюминесцентный анализ взвеси. Готовят опытную пробу следующего состава для регистрации индуцированной хемилюминесценции: донорская сыворотка (группа крови АВ, резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол в концентрации 100 мкг/мл, интерферон, например реаферон, в концентрации 1 млн МЕ/мл (соответствует лечебной дозе 3 млн ME), неспецифический стимулятор выработки активных форм кислорода фагоцитирующих клеток, например зимозан в концентрации 2 мг/мл. Готовят контрольную пробу следующего состава для регистрации спонтанной хемилюминесценции: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса и 50 мкл люминола. Опытная проба включает 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 220 мкл раствора Хенкса, 20 мкл реаферона и 50 мкл люминола. Спонтанную хемилюминесценцию регистрируют в течение 45 мин. Затем добавляют в обе пробы 40 мкл зимозана и регистрируют индуцированную хемилюминесценцию нейтрофильных гранулоцитов. Регистрацию хемилюминесценции проводят на хемилюминесцентном анализаторе, например, "CL3604". Управление хемилюминесцентным анализатором и регистрацию результатов ведут через компьютер. Получают кривые хемилюминесценции опытной (с реафероном) и контрольной (без реаферона) проб, каждая из которых имеет по два пика. Первый пик на каждой из кривых соответствует максимальному уровню спонтанной хемилюминесценции, второй - индуцированной.

Определяют величины площади под первым (Sспон ) и вторым (Sинд) пиком хемилюминесцентной кривой в контрольной пробе. Рассчитывают индекс активации нейтрофильных гранулоцитов в контрольной пробе

ИА=Sинд /Sспон

Определяют величины площади под первым (SIFNспон) и вторым (S IFNинд) пиком хемилюминесцентной кривой в опытной пробе. Рассчитывают индекс активации нейтрофильных гранулоцитов в опытной пробе

ИАIFN=SIFNинд /SIFNспон

Рассчитывают индекс чувствительности

ИЧ=ИАIFN/ИА

ИЧ, превышающий 1,0, свидетельствует о чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к интерферону: больному рекомендуют интерферонотерапию. ИЧ, равный или меньший 1,0, свидетельствует об отсутствии чувствительности: интерферонотерапия неэффективна.

Клинический пример 1. Больной Т., 44 года. История болезни №.1496/125. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении ККОД с 2.03.04. по 26.03.04. с диагнозом: рак правой почки, Т 3М0М0. Операция 16.03.04., проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия справа, дренирование забрюшинного пространства. Гистологическое исследование №:11760-77 в препарате картина светлоклеточного почечно-клеточного рака. Течение послеоперационного периода гладкое.

Проведен хемилюминесцентный анализ реактивности нейтрофильных гранулоцитов и чувствительности к интерферону in vitro. Определен ИЧ.

ИЧ=11,63/6,73=1,73, что отражает наличие чувствительности нейтрофильных гранулоцитов у данного пациента при воздействии интерферона in vitro.

Дополнительно проведен контрольный анализ интерферонового статуса. Выявлена недостаточность спонтанной и стимулированной продукции интерферона- . Пациент получил курс иммунотерапии реафероном.

Клинический пример 2. Больная X., 47 лет. История болезни №.1624/436. Находилась на стационарном лечении в урологическом отделении ККОД с 03.03.04. по 30.03.04. с диагнозом: рак правой почки, Т3Т0М 0. Операция 23.03.04, проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия справа, дренирование забрюшинного пространства. Гистологическое исследование №:12459-77 в препарате картина почечноклеточного рака, светлоклеточный вариант, инвазия в капсулу. Течение послеоперационного периода гладкое.

Проведен хемилюминесцентный анализ функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и чувствительности к интерферону in vitro. Определен ИЧ.

ИЧ=0,70/0,78=0,90, что отражает наличие отрицательной функциональной реакции у пациентки при воздействии интерферона in vitro.

Дополнительно проведен контрольный анализ интерферонового статуса. Не выявлено недостаточности продукции интерферона- . Пациентке курс интерферонотерапии не рекомендован.

Предлагаемым способом обследовано 132 человека. Достоверность различий определялась по критерию Манна-Уитни.

Способ позволяет повысить эффективность интерферонотерапии у больных раком почки за счет сокращения времени исследования (2,5 часа вместо 6-7 дней в способе-прототипе), упрощения способа и снижения стоимости, так как не требует наличия стерильного бокса и дорогостоящих реактивов.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ оценки чувствительности к интерферону у больных раком почки, заключающийся в биологическом исследовании терапевтической активности интерферона, отличающийся тем, что при исследовании крови пациента in vitro с помощью хемилюминесцентного анализа функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов определяют индекс чувствительности (ИЧ), представляющий собой отношение индекса активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (ИАIFN) к индексу активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона (ИА), причем ИА IFN представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNинд.) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона (SIFNспон.), а ИА представляет собой отношение площади под кривой хемилюминесценции индуцированных нейтрофильных гранулоцитов (Sинд) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов (Sспон.), о чувствительности к интерферону судят по отклонению ИЧ от 1,0, при этом ИЧ, превышающий 1,0, свидетельствует о чувствительности к интерферону, а ИЧ, меньший или равный 1,0, свидетельствует об отсутствии чувствительности к интерферону.