СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ


RU (11) 2076151 (13) C1

(51) 6 C12N15/28, C07K14/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.03.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 3955012/13 
(22) Дата подачи заявки: 1985.07.04 
(31) Номер конвенционной заявки: 06/628059 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1984.07.05 
(33) Страна приоритета: US 
(45) Опубликовано: 1997.03.27 
(56) Аналоги изобретения: Патент СССР N 1614765, кл. C 12 N 15/28, 1990. 
(71) Имя заявителя: Генентек, Инк. (US) 
(72) Имя изобретателя: Бхарат Бхасан Аггарвал[IN]; Давид Ваннорман Геддель[US]; Санг Ни Ли[US]; Гленн Эван Недвин[US] 
(73) Имя патентообладателя: Генентек, Инк. (US) 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ 

Использование: молекулярная биология, лимфокинез, в частности цитотоксические факторы, секретируемые лимфатическими клетками. Сущность изобретения: получен ФНО путем культивирования индуцированных человеческих клеток HL-60 или PBLS с последующим выделением и очисткой целевого продукта последовательной хроматографией на стеклянных шариках, на моно-Q-смоле для быстрой жидкостной хроматографии, а затем препаративным электрофорезом на ДS полиакриламидном геле и ПААТ-электрофорезом или жидкостной хроматографией на C4 обратной фазе. Полученный человеческий ФНО способен к разрушению или ингибированию опухолевых клеток и имеет следующие свойства: молекулярный вес 17000 дальтон (при определении SDS PAGE), изоэлектрическую точку 5.3, специфическую активность 10 мл ед./мг белка, не гликозилирован. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к цитотоксическим факторам, которые секретируются лимфатическими клетками, и к способам их получения, В-клетки, Т-клетки и макрофаги вырабатывают вещества, которые проявляют цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам, но которые являются безвредными для нормальных клеток. Эти вещества имеют различные названия, например лимфотоксин, фактор некроза опухоли, цитотоксический фактор НК клетки, фактор гемморганического некроза, макрофаговый цитотоксин или цитотоксический макрофаговый фактор. В настоящее время идентичность протеинов, связанных с этими названиями, неясна. Принципиальные трудности заключаются в том, что биологические анализы, применяемые для обнаружения протеинов, не дают различия между ними, протеины находятся в природе в виде агрегатов или гидролитических продуктов, и следовательно, полученные количества являются настолько малыми, что не была достигнута необходимая высокая степень очистки, чтобы полностью охарактеризовать протеины.

Обычно такие цитотоксические вещества находятся в сыворотке интактных животных или в надосадочных слоях культуры лимфатических клеток или клеточных линий, после того как животные или клетки были обработаны веществом, известным для стимуляции пролиферации иммунных клеток ("индуктором"). После этого сыворотку или надосадочный слой извлекают и проверяют на цитотоксическую активность по отношению к клеточной линии опухоли-мишени. Стандартной мишенью является L-929, клеточная линия мышиной опухоли. Эта клеточная линия и другие, используемые в биопробах этого типа, являются неспецифическими по их литическому ответу, потому что множество раздельных продуктов лимфатических клеток, по-видимому, способны вызывать лизис. Подобные неспецифические ответы наблюдаются при анализе in vitro некроза опухоли. Итак, цитолитические пробы, которые наблюдаются при лизисе клеточных линий in vitro или некроза опухоли in vivo, являются неадекватными для различения среди различных цитотоксических лимфатических продуктов.

Цитотоксические факторы классифицируют с учетом того, какими клетками они индуцируются. Например, название лимфотоксин обычно применяется к цитотоксически секреторным продуктам В и Т лимфоцитов или клеточных линий, которые происходят из этих лимфоцитов. Фактором некроза опухоли называют цитотоксические продукты макрофагов или клеточных линий, полученных из макрофагов.

Были сделаны попытки очистить и охарактеризовать цитотоксические факторы, секретируемые каждым типом клеток. Имеющиеся различные сообщения о свойстве цитотоксического фактора или являются полностью противоречивыми в отношении данного свойства, можно сделать вывод, что или эта характеристика является ошибочной, или что каждой клеткой этого типа секретируется множество раздельных цитотоксических факторов. Например, цитотоксические продукты, происходящие из макрофагов, моноцитов или моноцитических клеточных линий, которые иногда упоминаются как фактор некроза опухоли, по сообщениям обладают свойствами, которые кажутся противоречащими теории единого цитотоксического продукта (1-3). I. Hammurstrom, Scan I. Immulol. 15:311-318, 1982.

Предполагают, что лимфотоксин морской свинки и цитотоксический фактор макрофагов морской свинки являются иммунохимически подобными, если не идентичными (4-5).

Попытки охарактеризовать иммунные цитотоксические факторы также были сфокусированы на использовании в качестве исходного материала сыворотки или внутрибрюшинной жидкости животных, которые были обработаны иммуногенными антигенами (6-10).

Известен цитотоксический полипептид, который был очищен от примесей из культуры человеческих лимфобластоидных клеток. Этот полипептид был назван лимфотоксином, хотя его отношение к другим описанным цитотоксическим полипептидам под названием лимфотоксин является предположительным. Не известно, является ли он единственным цитотоксическим полипептидом, вырабатываемым иммунными клетками, или же он является одним из потенциального семейства цитотоксических факторов (17).

Этот полипептид имеет две концевые аминогруппы, оканчивается Лей Про Гли Вал Лей Тр Про Сер Ала Ала Гли Тр Ала Арг Гли Гис Про Лиз Мет Гис Лей Ала Гис Сар Тр. и меньший вариант с усеченной концевой аминогруппой Гис Сер Тр Лей Лиз Про Ала Ала.

В соответствии с известными литературными данными интерфероны, которые обладают некоторой активностью ингибирования опухолей, и недостаточно охарактеризованный протеин, имеющий на конце Ала Ала, являются кандидатами для нелимфотоксических цитотоксических факторов. Как будет показано, фактор некроза опухоли настоящего изобретения не является интерфероном, не является лимфотоксином и не имеет Ала Ала окончания.

Ближайшим аналогом заявленного способа является способ получения фактора некроза опухоли из крови кроликов, которым предварительно вводят 50 мг умерщвленных сухих клеток Pro pionl-bacterium acnes путем фильтрации плазмы и нанесения фильтрата на колонку ДЕАЕ-Sephorose CL-6В с последующей повторной хроматографией на ДЕАЕ-Sharose CL-6В и дальнейшей очисткой ультрафильтрацией, хроматографией на Sephocryl 8-20, ультрафильтрацией, хроматографией на Zn2+ хелатной сефарозе и на Тоgoperl HW-55 (18).

Цитотоксический фактор был очищен до гомогенности, охарактеризован. Этот фактор для удобства обозначен как фактор некроза опухоли (ФИО) (ТNF) и определен ниже. Его получают в по существу гомогенном виде из культуры клеток при удельной активности больше 10 мил.

Фактор некроза опухоли может быть получен путем культивирования клеточных линий животных, а именно индуцированных моноцитических клеточных линий, при выращивании в присутствии 4-бета-форбол-12-министат-13-ацетате (РМА) или клеточных линий, таких как гибридомы или ЕBV трансформированные клетки. При этом фактор некроза опухоли получают в результате очистки, извлекая надосадочную культуральную жидкость или лизированную клеточную культуру, удаляя твердые вещества, адсорбируя фактор некроза опухоли из надосадочной смеси (содержащей фактор некроза опухоли и другие протеины) на гидрофобное вещество, элюируя фактор некроза опухоли с вещества, адсорбируя фактор некроза опухоли на анионообменную смолу с третичными аминогруппами, элюируя фактор некроза опухоли со смолы, адсорбируя фактор некроза опухоли на анионообменную смолу (предпочтительно замещенную четвертичными аминогруппами), имеющую практически однородный размер частиц, и элюируя фактор некроза опухоли со смолы. В некоторых случаях композиции фактора некроза опухоли концентрируют и очищают хроматофокусированием в любой точке процедуры очистки, например, изоэлектрическим фокусированием, или пропусканием через молекулярно-ситовой гель, такой как Сефадекс С-25.

Очищенный фактор некроза опухоли индуцированной клеточной культуры объединяют для терапевтического применения с физиологически безвредными стабилизаторами и экципиентами и получают в виде дозированных форм путем лиофилизации в дозировочных сосудах, или хранят в виде стабилизированных водных препаратов. Альтернативно, фактор некроза опухоли включают в полимерную матрицу для имплантации в опухоли или в хирургические участки, из которых опухоли были вырезаны, в результате чего проводится пролонгированное выделение фактора некроза опухоли с локализованной высокой концентрацией.

Полученные здесь композиции свободны от загрязняющих цитотоксических факторов, таких как лимфотоксин, интерфероны или другие цитотоксические протеины, упоминаемые в литературе. Однако при терапевтическом применении фактор некроза опухоли выгодно сочетать с заранее определенными количествами лимфотоксина и/или интерферона. Композиции, содержащие фактор некроза опухоли и интерферона, такой как гамма-интерферон, являются особенно полезными, так как было обнаружено, что они проявляют синергитическую цитотоксическую активность.

Композиции фактора некроза опухоли вводят животным, в частности пациентам, имеющим злокачественные опухоли, в терапевтически эффективных дозах. Подходящие дозы могут быть определены врачом в терапевтическом контексте.

На фиг.1 показан профиль элюирования фактора некроза опухоли со стекла с контролируемыми порами; на фиг.2 то же, с диэтиламиноэтилцеллюлозы; на фиг. 3 то же, при скоростной жидкостной хроматографии протеинов; на фиг.4 то же, при хроматофокусировании; на фиг.5 молекулярная масса фактора некроза опухоли при электрофорезе на СДС НААГ геле; на фиг.6 то же, при элюировании с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; на фиг.7 профиль элюирования фактора некроза опухоли с колонки при высокоэффективной жидкостной хроматографии; на фиг.8 разделение фрагментов трипсинового перевара фактора некроза опухоли высокоэффективной жидкостной хроматографией; на фиг.9 - цитотоксическое действие смесей гамма-интерферона и фактора некроза опухолей; на фиг. 10 нуклеотидная и аминокислотная последовательности для префактора человеческого некроза опухоли, включая полный секреторный лидер фактора некроза опухоли.

Фактор некроза опухоли определен как полипептид, другой, чем лимфотоксин, обладающий предпочтительной цитотоксической активностью и имеющий область, обладающую функциональной аминокислотной гомологией с аминокислотной последовательностью зрелого фактора некроза опухоли, представленной на фиг. 10, его фрагмент или производное такого полипептида или фрагмента.

Предпочтительная цитотоксическая активность определяется как предпочтительная деструкция или ингибирование роста опухолевых клеток по сравнению с обычными клетками в тех же самых условиях. Предпочтительная цитотоксическая активность определяется по действию полипептида на опухолевые клетки in vivo или in vitro по сравнению с нормальными клетками или тканью. Этот лизис обычно является диагностическим индикатором in vitro, тогда как некроз опухоли определяется в эксперименте in vivo. Однако, цитотоксическая активность может быть доказана как цитостазис или антипролиферирующая активность. Хорошо известны подходящие аналитические системы.

Удельная активность фНО подсчитывается в переводе на целевой лизис клеток, а на цитостазис. Одна единица фактора некроза опухоли определяется как количество, требующееся для 50%-ного лизиса целевых клеток, помещенных в каждое углубление в соответствии с примером 1. Однако это не означает исключение других анализов для измерения удельной активности, а именно, методов, основанных на скорости роста целевых клеток.

ПрефНО является видом фактора некроза опухоли, включенным в вышеупомянутое определение фактора некроза опухоли. Он характеризуется наличием в молекуле сигнального или лидерного полипептида, который служит для посттрансляционного переноса протеина на участок внутри или вне клетки. Обычно сигнальный полипептид (который не обладает некротирующей опухоль активностью) протеолитически отщепляется от остаточного протеина, имеющего активность фактора некроза опухоли как часть секреторного процесса, в котором протеин транспортируется в периплазму клетки или культуральную среду. Сигнальный пептид может быть микробным или млекопитающим (включающим нативную препоследовательность 76 остатков), но предпочтительно является сигналом, который является гомологичным к клетке хозяина.

Нативный фактор некроза опухоли из нормальных биологических источников имеет расчетную молекулярную массу около 17000 при электрофорезе на додецилсульфонатриевом полиакриламидном геле (СДС-ПААГ), как описано ниже, изоэлектрическую точку около 5,3, и восприимчивость к гидролизу трипсином на множестве участков. Нативный фактор некроза опухоли, который был очищен высокоэффективной жидкостной хроматографией с обратной фазой, гидролизуется трипсином по крайней мере на девять фрагментов в условиях, описанных ниже. Точное количество фрагментов, на которое гидролизуется трипсином фактор некроза опухоли, будет зависеть от таких факторов, как активность трипсина, концентрация фактора некроза опухоли и параметры инкубирования, включая ионную силу, рН, температуру и время инкубирования.

Фактор некроза опухоли, вероятно, не является гликопротеином, так как он не удерживается на лектиновых афинных колонках и не содержит подобных участков гликозилирования.

Степень гомологичности аминокислотной последовательности, кодирующей фНО, будет варьировать в зависимости от того, будет ли гомология между протеином-кандидатом и фактором некроза опухоли попадать внутрь области фактора некроза опухоли, ответственной за цитотоксическую активность; области, которые являются критическими для цитотоксической активности, должны обладать высокой степенью гомологии. Последовательности, обеспечивающие конформацию фактора некроза опухоли или эффективный связывающий рецептор, могут показывать сравнительно низкую гомологичность. Кроме того, практически области могут проявлять цитотоксическую активность и еще оставаться гомологичными, как определено здесь, если остатки, содержащие функционально подобные аминокислотные боковые цепи, являются замещенными. Функциональное подобие относится к доминантным характеристикам боковых цепей, таких как основная, нейтральная или кислая, или наличие или отсутствие стерического блока. Однако фактор некроза опухоли, как определено здесь, специфически исключает лимфотоксин.

Обычно полипептид, определенный как фактор некроза опухоли, должен содержать области, по существу гомологичные с протеином фиг.10 или его фрагментом в непрерывном блоке примерно от 20 до 100 аминокислотных остатков, в частности, блоках, составленных остатками 35-66 и 110-133.

Наиболее существенным фактором при доказательстве идентичности полипептида как фактора некроза опухоли является способность антисыворотки, которая может по существу нейтрализовать цитолитическую активность зрелого фактора некроза опухоли, также нейтрализовать цитолитическую активность рассматриваемого полипептида. Однако, следует указать, что иммунологическая идентичность и цитотоксическая идентичность не являются необходимо сосуществующими. Нейтрализующее антитело для фактора некроза опухоли может не связывать протеин-кандидат, потому что нейтрализующее антитело не связывается со специфическим участком на факторе некроза опухоли, который является критическим для его цитотоксической активности. Действительно, антитело может связывать безвредную область и проявлять свое нейтрализующее действие путем стерического препятствия. Следовательно, протеин-кандидат, мутированный в этой безвредной области, может больше не связывать нейтрализующее антитело, но тем не менее он не будет фактором некроза опухоли с учетом гомологичности и биологической активности.

Важно отметить, что такие характеристики, как молекулярная масса, изоэлектрическая точка и т.п. для нативного или зрелого фактора некроза опухоли, полученного из периферических лимфоцитов или при культивировании определенных клеточных линий, являются наглядными только для нативных видов фактора некроза опухолей. Фактор некроза опухоли, как рассматривалось в приведенном выше определении, будет включать другие виды, которые не будут обладать всеми характеристиками нативного фактора некроза опухоли. Хотя фактор некроза опухоли, как определено здесь, включает нативный фактор некроза опухоли, другие относительно цитотоксические полипептиды будут попадать под это определение. Например, производные фНО типа мутантов со вставкой, мутантов с делецией или сшитые протеины, описанные выше, не будут обладать молекулярной массой, установленной для нативного фактора некроза опухоли (сшитые протеины со зрелым фактором некроза опухоли или сам префНО, а также мутанты со вставками будут иметь большую молекулярную массу, чем нативный зрелый фактор некроза опухоли, тогда как делеционные мутанты нативного зрелого фактора некроза опухоли будут иметь меньшую молекулярную массу). Подобным образом фактор некроза опухоли может быть сконструирован для того, чтобы снизить или устранить способность к гидролизу трипсином или другими протеазами. Наконец, пост-трансляционная обработка человеческого префНО в клеточных линиях, происходящих из неприматных млекопитающих, может вызывать микрогетерогенность в концевой аминной области, так что валин не будет больше аминоконцевой аминокислотой.

Аминокислотная последовательность для человеческого фактора некроза опухоли приведена на фиг.10. Зрелый или нативный фактор некроза опухоли представлен аминокислотными остатками 1-157. Отметим, что эта последовательность включает 76 остатков сигнальной последовательности, которые, как считается, должны быть удалены во время нормальной переработки трансляционной транскрипцией для получения зрелого протеина. Сайты гидролиза трипсином указаны стрелками.

Отметим, что выражение "способный" к цитотоксической активности или некроз опухоли in vivo означает, что термин фактор некроза опухоли включает полипептиды, которые могут быть превращены, например, ферментным гидролизом из неактивного состояния аналога с цимоген до пептидного фрагмента, который обладает желаемой биологической активностью. Обычно неактивный предшественник должен быть слитым протеином, в котором зрелый фактор некроза опухоли связан пептидной связью по ее карбоксильному концу с человеческим протеином или его фрагментом. Последовательность в этой пептидной связи или вблизи выбрана таким образом, что она должна быть восприимчива к протеолитическому гидролизу для выделения фактора некроза опухоли или in vivo, или in vitro. Генерированный таким образом фактор некроза опухоли тогда должен проявлять требуемую по определению цитотоксическую активность.

Хотя обычно фактор некроза опухоли означает средний человеческий фактор некроза опухоли, фактор некроза опухоли из таких источников, как murine свиной, конский, бычий, включены в определение фактора некроза опухоли, если они имеют гомологичные области и цитотоксическую активность. фНО не является специфическим типом, а именно, человеческий фНО является активным для опухолей мышей. Следовательно, фНО одного вида может быть использован при терапии другого.

Фактор некроза опухоли также включает мультимерные формы. Фактор некроза опухоли спонтанно агрегирует в мультимеры, обычно димеры или высшие мультимеры. Мультимеры являются цитотоксическими и, следовательно, пригодны для использования при терапии in vivo. Хотя желательно экспрессировать и извлекать фактор некроза опухоли в виде по существу гомогенного мультимера или мономера, фактор некроза опухоли может быть использован терапевтически в виде смеси различных мультимеров.

Ковалентные производные получают связыванием по группам, которые находятся в боковых аминокислотных цепях фНО или по N- или С-концевым группам с помощью известных способов. Эти производные могут включать, например: алифатические сложные эфиры или амиды карбоксильных концевых групп или остатков, содержащие карбоксильные боковые цепи, например, asp 10; О-ацилпроизводные остатков, содержащих гидроксильные группы, такие как Ser52, Ser3, Ser4 или Ser5, N-ацилпроизводные по концевой аминогруппе аминокислоты или остатки, содержащие аминогруппу, например, лизин или аргинин; и производные cys 101 и cys 69. Ацильную группу выбирают в группе алкильных фрагментов (включая С3-С10 нормальные алкилы), в результате чего образуются алканоильные виды, и карбоциклические или гетероциклические соединения, в результате чего образуются ароильные виды. Предпочтительно реактивные группы являются дифункциональными соединениями, известными вообще для использования в сшивке протеинов с нерастворимыми матрицами через реактивные боковые группы. Предпочтительными деривационными участками являются остатки у цистеина и гистидина.

Ковалентные или агрегативные производные являются полезными в качестве реагентов в иммуноанализе или для процессов аффинной очистки. Например, фактор некроза опухоли инсолюбилизируется ковалентными связыванием с сефарозой, активированной цианогенбромидом по известным методикам, или адсорбируется на полиолефиновых поверхностях (со сшивкой глутаровым альдегидом или без нее) для использования при анализе или очистке антител анти-фНО или рецепторов поверхности клетки. Фактор некроза опухоли также метится детектируемой группой, например, радиоиодирован по способу с хлорамином Т, ковалентно связан с хелатами редкоземельных металлов или конъюгирован с другим флюоресцентным фрагментом для использования в диагоностических целях, в особенности для диагноза уровня фНО в биологических образцах при иммуноанализе конкурентного типа. Такие производные могут выпадать из определения фНО, данного выше, потому что нет необходимости, чтобы они обладали цитотоксической активностью, только активностью к сшивке с антифНО.

Гомогенный фактор некроза опухоли означает фактор некроза опухоли, который практически не содержит других протеинов, нативных для источника, из которого выделен фактор некроза опухоли. Это означает, что гомогенный фактор некроза опухоли практически не содержит протеинов плазмы крови, таких как альбумин, фибриноген, протеазы серина, альфа-глобулины; цитотоксических полипептидов, а также таких как лимфотоксин или интерфероны, или других протеинов клетки или организма, включая целые клетки и определенный клеточный дебрис. Однако, гомогенный фактор некроза опухоли может включать такие вещества, как стабилизаторы и эксципиенты.

Клетки, синтезируюище фактор некроза опухоли, клеточной линии HL-60, первоначально культивируют традиционным способом до тех пор, пока не достигнут плотности около 8-12105 клеток/мл. Клетки извлекают из культуры, промывают, переносят на свободную от сыворотки среду и выращивают в среде, содержащей РМА. Затем продолжают культивирование до тех пор, пока не будет накоплена желаемая концентрация фактора некроза опухоли в культуральной среде, обычно около 400 единиц фактора некроза опухоли/мл. После этого надосадочный слой культуральной жидкости предпочтительно осветляют центрифугированием или другими средствами отделения клеточного дебриса от растворимых компонентов. Центрифугирование следует проводить при низких скоростях, чтобы приходили в движение только суспендированные частицы. Затем очищают надосадочный слой.

Вначале фактор некроза опухоли извлекают из культур. Клетки лизируют ультразвуком или другим подходящим способом, дебрис определяют центрифугированием, тогда как надосадочные слои от секретирующих клеток (таких как индуцированные клеточные линии) просто отделяют от клеток центрифугированием. Для очистки фактора некроза опухоли используют следующий метод, степень очистки будет достаточной для определения последовательности аминокислотных остатков.

В качестве начальной стадии очистки фактор некроза опухоли адсорбируют на гидрофобном веществе из лизированной культуры или надосадочного слоя культуральной среды. Гидрофобное вещество предпочтительно является веществом с нежелатиноподобной поверхностью, таким как силикат или полиолефин, хотя также пригодна алкил Сефароза. Предпочтительным вариантом является стекло с контролируемыми порами. Примерно 1 объем стекла с контролируемыми порами смешивают с 50 объемами надосадочного слоя и проводят адсорбцию или примерно 4oC без перемешивания в течение периода времени от примерно 30 мин до 2 ч, предпочтительно примеpно 1 ч, в слабощелочных условиях. Обычно после этого адсорбент следует промыть подходящим буфером для удаления увлеченных загрязнений протеинов.

Адсорбированный фактор некроза опухоли элюируют с гидрофобного вещества путем изменения сельватационных свойств окружающей среды. Элюирование может быть осуществлено путем пропускания раствора, забуферированного при рН приблизительно 7-8,5, предпочтительно около 8, содержащим 1М соли и эффективное количество водного раствора смешивающегося с водой органического полиола, такого как, например, этиленгликоля или глицерина, обычно этиленгликоля, в количестве 10-30% объем/объем, предпочтительно около 20% объем/объем. Разумеется, оптимальные условия будут зависеть от использованного полиола. Элюированные фракции, содержащие фактор некроза опухоли, детектируют пробой in vitro, как описано ниже, или другой подходящей пробой. Очистка и выход этой стадии из культуры моноцитных клеток, а также на последующих стадиях приведены ниже в таблице.

Дальнейшую очистку осуществляют при адсорбции фактора некроза опухоли анионообменной смолой с третичными или четвертичными аминогруппами. Предпочтительными смолами для этой цели являются гидрофильные матричные смолы, такие как сшитый полистирол, декстран или целлюлоза, замещенные третичными или четвертичными алкил аминогруппами. Коммерческие продукты этого типа являются доступными в качестве ДЕАЕ целлюлозы, ОАЕ Сефадекса или под торговым названием Моно Q (в каждом случае, где этил является алкильным заместителем в каждом из этих продуктов). Самые хорошие результаты были достигнуты с быстродействующей протеиновой жидкостной хроматографической системой, описанной при использовании макропористых по существу однородных частиц. Эта система пригодна для очистки фактора некроза опухоли до высокого уровня.

Очистка до практической гомогенности достигается только при последующем разделении при электрофорезе на СДС НААГ или жидкостной хроматографии при высоком давлении на С4-обратимой фазе (НРLC), как описано в примерах ниже. Однако этот продукт является нежелательным для терапии, потому что он в значительной мере потерял активность при действии органического растворителя НРLC или SДА. Во время заключительных стадий очистки концентрация протеина устанавливается по аминокислотному составу и также не аминокислотной последовательности.

Фактор некроза опухоли сшивают с физиологически приемлемыми носителями, а именно носителями, которые являются нетоксичными при применяемых дозировках и концентрациях. Обычно следует сочетать фактор некроза опухоли с буферами, антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными полипептидами (менее примерно 10 остатков), протеинами, аминокислотами, углеводами, включая глюкозу или декстрины, хелатирующими агентами, такими как ЕДТА, и другими стабилизаторами и экципиентами. Носитель должен быть сформулирован для стабилизации фактора некроза опухоли в виде димера и/или, предпочтительно, тримера. Это осуществляется путем устранения солей или детергентов в концентрации, при которых фактор некроза опухоли диссоциирует на мономеры. Следует избегать условий, при которых фактор некроза опухоли агрегирует в высшие мультимеры. Обычно применяют неионное поверхностно-активное вещество, такой как Твин 20, чтобы обеспечить избыточную агрегацию во время очистки, а также лиофилизацию при хранении в воде. Фактор некроза опухоли, который будет использован для терапевтического введения, должен быть стерильным. Это легко осуществляется при фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Фактор некроза опухоли обычно должен храниться в лиофилизированной форме. Очистка человеческого фактора некроза опухоли из культуральной среды BL-60 клеток приведена в таблице.

Фактор некроза опухоли иногда сочетают с другими антинеопластическими агентами, такими как хемотерапевтические антибиотики (актиномицин-Д, адриамицин, аклациномицин А) или с агентами для повышения или стимуляции иммунного ответа, например, иммуноглобулинами, такими как гамма-глобулин, включая иммуноглобулины, имеющие сродство с антигенами неоплазмы поверхности клеток. Кроме того, так как интерфероны действуют синергетически с фактором некроза опухоли в пробах на лизис клетки, желательно сочетать композиции фактора некроза опухоли с альфа-, бета- или гамма-интерфероном, или сочетать эти интерфероны с композициями, содержащими фактор некроза опухоли и лимфотоксин. Типичная рецептура включает фактор некроза опухоли и гамма-интерферон в пропорции по единицам активности от примерно 0,1:1 до 200:1, обычно 10:1, и могут содержать лимфотоксин вместо пропорции фактора некроза опухоли. Разумеется, эта пропорция подвергается модификации, как требуется терапевтическим экспериментом.

Композиции фактора некроза опухоли вводят животным, имеющим опухоли. Путь введения определяется в соответствии с известными способами, а именно внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интралезиональной инфузией или инъекцией стерильных растворов фактора некроза опухоли, или путем систем продленного действия, как отмечается ниже. Фактор некроза опухоли вводят интралезионно, а именно прямой инъекцией в твердые опухоли. В случае рассеянных опухолей, таких лейкемия, введение является предпочтительно внутривенным или в лимфатическую систему. Опухоли абдоминальных органов, такие как рак яичников, выгодно лечить путем интраперитонеальной инфузии, используя hard ware перитонеальный анализ и перитонеально совместимые растворы. Однако, обычно фактор некроза опухоли вводят непрерывной инфузией, хотя приемлема и инъекция с пищевым комком.

Желательно вводить фактор некроза опухоли из имплантированного изделия продленного действия. Примерами подходящей системы для протеинов, имеющих молекулярную массу димера или тримера фактора, являются сополимеры L-глютаминовой кислоты и гамма этил-L-глютамата, поли-(2-оксиэтилметакрилат или этиленвинилацетат). Это изделие имплантируется в хирургические участки, из которых опухоли были вырезаны. Альтернативно, фактор некроза опухоли микрокапсулируют в полунепроницаемые микрокапсулы или липосомы для инъекции в опухоль. Этот способ введения является особенно полезным для хирургически неизвлекаемых опухолей, например опухоли головного мозгa.

Количество фактора некроза опухоли, которое должно быть ведено, будет зависеть, например, от пути введения, вида опухоли и состояния пациента. Инъекции внутрь поражения будут требовать меньше фактора некроза опухоли на основу веса тела, чем при внутривенной инфузии, хотя опухоли некоторых типов, например твердые опухоли, кажутся более устойчивыми к фактору некроза опухоли, чем другие, например лейкемические. Следовательно, врачу необходимо оттитровать дозу и модифицировать путь введения, как требуется, чтобы получить оптимальную цитотоксическую активность по отношению к опухоли, которая также может быть определена, например, биопсией опухоли или диагностической пробой на путативные раковые маркеры, такие как карциноэмбрионный антиген. Обычно дозировки фактора некроза опухоли на мышах до примерно 120 мкг/кг веса тела/день при внутривенном введении были найдены практически нетоксичными и эффективными in vivo.

Считают, что фактор некроза опухоли не является специфическим видом по его цитотоксической активности, так что фактор некроза опухоли, другой, чем человеческий фактор некроза опухоли, например из бычьего или свиного источника, может быть применен при терапии человеческих опухолей. Однако, желательно использовать фактор некроза опухоли от подлежащих лечению видов, чтобы избежать потенциальной генерации аутоантител.

Пример 1.

Проба

Удельную активность фактора некроза опухоли определяют по модифицированному анализу лизиса клеток. Фибробластные клетки L-929 мышей (ATCC CCL-929) выращивают в 96 углублениях плоскодонных подносов (3040, Фелкон Пластикс, Оксперд, СА) по 30000 клеток (объемом 0,1 мл) на углубление в присутствии 1 мкг/мл актиномицина Д и серийно разбавленного опытного образца (0,125 мл). Клетки инкубируют во влажной атмосфере при 37oC с 5% СО2. Испытуемый образец извлекают через 18 ч, бляшки промывают и определяют лизис клеток путем окрашивания бляшек 0,5%-ным раствором кристаллического фиолетового в смеси метанол: вода 1:4 (объем/объем). Концевую точку при микротитровании бляшек определяют с помощью саморегистратора Микроэлиса (Дунатеч), по поглощению при 450 нм и пропусканию при 570 нм. Клетки, выдержанные в одной культуральной среде, дают 0% лизиса, а клетки, выдержанные в 3М растворе гуанидинхлорида, обеспечивают концевую точку при 100% лизиса. Одна единица фактора некроза опухоли определяется как количество фактора некроза опухоли (при определении в 0,125 мл объема), которое требуется для 50%-ного лизиса клеток.

Фактор некроза опухоли также испытывают в пробе in vivo на некроз опухоли. Короче, эту пробу проводят при выращивании клеток Meth. A. Sarcoma (5105 клеток) в CB6F1 самки мыши (BALB/c x C57BL (6) F1 в течение 7-10 дней, а затем инъецируют внутриопухолево образец фактора некроза опухоли. Через 24 ч мышей умерщвляют отрезанием головы, извлекают опухоль и гистологически подсчитывают некроз.

Пример 2

Использование РBL1 или моноцитной клеточной линии для синтеза фактора некроза опухоли

Засевают культуру НL-60 человеческой клеточной линией при плотности клеток 1105 клеток/мл, выращивают культуру в 2-литровых вращающихся колбах (890 см3, используя 500 мл среды RPM1 1640 (Ирвин Сайнтифик, Санто Ана, СА), содержащей 10 мМ НЕРЕS, 0,05 мМ бета-меркаптоэтанола, 100 единиц мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% плодной сыворотки теленка. После 3 дней при 37oC, когда культура достигнет плотности клеток 8-12105 клеток/мл, клетки собирают центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин, дважды промывают не содержащей сыворотки средой RPMI 1640 и переносят в ту же среду, как описано выше, без сыворотки при плотности клеток 15-20105 клеток/мл. Клетки выращивают в 2-литровых вращающихся колбах в присутствии 1Л нг/мл РМА. После 16-24 ч клетки извлекают фильтрацией через 3 мкм Силклин фильтр (Полл Тринити Микро Корп. Кортлэнд, НИ). Прозрачный фильтрат испытывают на активность фактора некроза опухоли и используют для последующей очистки и характеристики. Эта процедура дает примерно 400 единиц фактора некроза опухоли/мл надосадочного слоя культуральной среды.

Человеческие периферические моноциты крови также используют для получения фактора некроза опухоли. Тромбоцитперезисные остатки были получены от фирмы Америкэн Рэд Кросс, Бостон, МА и использованы в течение 24 ч после сбора. Первоначальное разделение моноцитов и эритроцитов было достигнуто центрифугированием на Фиколл-Гипак градиентах при 1000 g в течение 30 мин. Клетки, собранные на разделе фаз, три раза промывают забуфеpированным фосфатным солевым раствором. Моноциты, происходящие от каждого донора, выращивают отдельно в 2-литровых вращающихся колбах на свободной от сыворотки среде РМI 1640 при плотности клеток 2,5106 клеток/мл. Прибавляют к культуре по 1 мкг/мл каждого из стафилококкового энтеротоксина В (SEB) и рекомбинантного тимозин альфа-1 и инкубируют клетки в увлажненной атмосфере при 37oC с 10% СО2. После 24-72 ч, в зависимости от донора, собирают клетки надосадочного слоя и обрабатывают по методике, подобной описанной для клеток, происходящих из клеточной линии НL-60. Выход фактора некроза опухоли из PBLSI культур широко варьирует в зависимости от примененного индуцирующего агента. Добавление РМА к индукционной системе, описанной выше, повышает цитолитическую активность клеток надосадочного слоя. Однако, клетки надосадочного слоя содержат как фактор некроза опухоли, так и лимфотоксин (определение лимфотоксина или фактора некроза опухоли в смесях фактора некроза опухоли и лимфотоксина было выполнено при проведении литической пробы с испытуемыми образцами клеток, заранее инкубированными с нейтрализующим антителом кролика для фактора некроза опухоли или лимфотоксина, и определении остаточной активности в пробе лизированных L-929 клеток).

Пример 3.

Хроматография на стеклянных шариках с контролируемыми порами

Активность фактора некроза опухоли из клеточной культуры периодически абсорбируют стеклянными шариками с контролируемыми порами (Каталог N СPG 00350, Электро-Нуклеоникс, Файрфилд, НЙ), уравновешенными 10 мМ натрий фосфатного буфера, рН 8,0, при постоянном перемешивании при 4oC. Используют 100 мл стеклянных шариков на 5 л среды. После 1 ч перемешивания шарикам дают отстояться и декантируют надосадочный слой. Затем шарики выливают в колонку 5 х 50 см при комнатной температуре и промывают 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8,0, содержащим 1 М NaCl. Активность фактора некроза опухоли элюируют со стеклянных шариков 20%-ным этиленгликолем в 10 мМ натрий фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 1 М NaCl. Профиль элюции надосадочного слоя НL-60 из колонки показан на фиг.1.

Пример 4.

Хроматография на ДЕА целлюлозе

Элюат из примера 3 непосредственно наносят на колонну 2,5 х 20 см с ДЕАЕ целлюлозой 53 (Ватман), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатным буфером при рН 8,0 и 0,01% Твин 20, при скорости потока приблизительно 500 л/ч. После того, как скорость потока в колонке установится 100 мл/ч, вносят 4,2106 единиц фактора некроза опухоли в образце 1080 мл при 4oС, колонку промывают равновесным буфером и элюируют при возрастающих градиентах от 75, 150 и 500 мМ хлористого натрия в 10 мМ фосфатном буфере (рН 8,0). Элюат контролируют по поглощению при 280 нм и по активности фактора некроза опухоли как функции элюированных фракций. Результаты показаны на фиг.2.

Пример 5

Быстрая жидкостная хроматография протеинов

Фракцию активного фактора некроза опухоли из примера 4 концентрируют и диализируют против 20 мМ Трис НСl, рН 8,0, содержащего 0,01% Твин 20 и 1 мМ азида натрия (буфер А) в Амикон стирселл, используя УМ-10 мембрану или другую диализную мембрану, пропускающую молекулярные массы меньше, чем у фНО. Мембрану дважды промывают буфером А. Колонку, заполненную шариками Софарозы, замещенной четвертичными аммонийными группами (9,8 мкМ шариков в колонке 5 х 0,5 см, продается как Моно Q, смола, Фармациа в установке для быстрой жидкостной хроматографии протеином (FPLC), снабженной программируемым градиентом (GP-250) и двумя насосами (Р-500), предварительно уравновешивают буфером для диализа через суперпетлю при скорости потока 1 мл/мин. Собранные промывки и диализный концентрат загружают в колонку, колонку промывают буфером А, а затем элюируют при линейном градиенте 40-75 мМ хлористого натрия в буфере А. Линейные градиенты были запрограммированы следующим образом: 0-5 мин равновесный буфер, 5,1-15, 25 мМ NaCl, 15,1-25 мин, 40 мМ NaCl; 25-60 мин, 40-75 мМ NaCl линейный градиент; 60-65 мин, 75 мМ NaCl; 65,1-70 мин, 100 мМ NaCl; 70-80 мин, 100-10000 мМ NaCl линейный градиент, 80-90 мин 100 мМ NaCl. 90,1-110 мин равновесный буфер. Элюент собирают в виде фракций по 2 мл и контролируют по поглощению при 280 нм, проводимости и на активность фактора некроза опухоли. Результаты приведены на фиг.3.

Пример 6

Хроматофокусирование

Хроматофокусирование проводят, используя Фармацию Моно Р (колонку 20 х 0,5 см), в FPLC системе, как в примере 5. Биологически активную (фактор некроза опухоли) фракцию, элюированную во фракциях 37-45 в примере 5, концентрируют и диализуют на Амикон стир селл с УМ-10 мембраной против уравновешивающего буфера колонки, а именно, 0,025 м бис-Трис НСl, рН 6,7. Образец загружают в Моно Р колонку при комнатной температуре через суперпетлю при скорости потока 1 мл/мин. Колонку промывают радиовесным буфером до тех пор, пока поглощение при 280 нм не вернется к фоновой линии, а затем элюируют при линейном градиенте, установленном путем промывки колонки 7,5% полибуфера 74 при рН 4,7 (Фармация). Собирают фракции по 1 мл и регистрируют поглощение при 280 нм и рН эффлюента. Результаты показаны на фиг.4. Как можно видеть из фиг.4, изоэлектрическая точка фактора некроза опухоли находится примерно при 5,3.

Пример 7

Препаративный электрофорез на SDS-полиакриламидном геле

Готовят 50%-ный полиакриламидный гель (11 х 16 см) толщиной 1,5-3,0 мм. Как разрешающий, так и накапливающий гели, содержат 0,1% SDS и 0,05% Твин 20. Другие буферы и концентрации сшивающего агента были такими же, как для аналитического SDS-ПААГ геля. Активные фракции с фактором некроза опухоли из примеров 5 или 6 объединяют, сконцентрируют и диализуют против 6,25 мМ Трис НСl, рН 7,0, содержащего 0,005% SDS на Амикон стир селл, используя УМ-10 мембрану. После удаления диализованного концентрата мембрану три раза промывают малым объемом образца буфера (0,2% SDS, 0,02% Твин 20, 30% глицерина, 0,03 М трис НСl, рН 6,8, 0,005% индикаторного красителя). Диализованный концентрат и промывки объединяют (общий объем 1-4 мл), в некоторых случаях добавляют меркаптоэтанол, чтобы создать восстановительные условия SDS ПААГ, и вносят образец в большое углубление, отлитое в накапливающем геле. Маленькие углубления вблизи углубления с образцом используют для предварительного окрашивания маркерами молекулярной массы: фосфорилаза-а (94К), бычий сывороточный альбумин (67К), яичный альбумин (43К), карбоновая ангидраза (30К), ингибитор трипсина соевых бобов (20К), Лизоцим (14,4К). Гели заливают в Биорад вертикальную электрофоретическую систему, охлажденную до 12oС при постоянном токе 20 мА/мм толщины геля, до тех пор, пока индикаторный краситель не достигнет дна геля.

После электрофореза одну из стеклянных пластин снимают с геля и отмечают положения маркеров молекулярной массы. Затем разрезают узкую полоску, содержащую образец нанесенного фактора некроза опухоли, на секции по 0,25 см в соответствии с молекулярными массами маркерных протеинов. Эти кусочки геля затем помещают в полипропиленовые трубки, содержащие 1-2 мл 10 мМ бикарбоната аммония, и 0,01% Твин 20, рН 8, и проводят элюирование в течение 16 ч при 4oC. Элюаты затем испытывают на активность фактора некроза опухоли, результаты представлены на фиг.5. Молекулярная масса фактора некроза опухоли на SDS геле составляет около 17000 как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях, указывая таким образом на одноцепочечную молекулу.

Протеин извлекают из элюата кусочков геля, свободного от солей и низкомолекулярных веществ, при следующей обработке: готовят маленькие колонки, содержащие 0,2 мл смолы Сеп-пак С18, которую предварительно промывают ацетонитрилом, 1-пропанолом, 10$-ной трифторуксусной кислотой (ТФУК) и дистиллированной водой, а затем уравновешивают 10 мМ бикарбоната аммония, содержащего 0,01% Твина 20, рН 8,0. Элюат геля загружают в колонку и собирают элюент. Затем смолу промывают приблизительно 5 мл каждого из дистиллированной воды и 0,1% -ной ТФУК для удаления свободных аминокислот и буферных солей. Фактор некроза опухоли элюируют из смолы 1 мл 50%-ного 1-пропанола в 0,1%-ной ТФУК. Далее проводят элюирование 1 мл каждого из 50%-ного 1-пропанола в 1%-ной ТФУК и 99%-ным 1-пропанолом в 1%-ной ТФУК, но протеин обычно элюируют первым буфером. Приблизительно 80% биоактивности фактора некроза опухоли инактивируется на этой стадии. Хотя полученный таким образом фактор некроза опухоли может быть применен для анализа последовательности аминокислот, предпочтительно, чтобы для этой цели был использован элюент высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанный ниже в примере 8.

Пример 8

Жидкостная хроматография при высоком давлении (высокоэффективная жидкостная хроматография), (НРLC)

Молекулярную массу нативного интактного фактора некроза опухоли определяют гель-проникающей хроматографией при высоком давлении. Последнюю проводят при комнатной температуре, используя TSK G 2000 SW гель в НРLC колонке (Аллтеч Ассосиэйтед, Дирфилд, ИЛ), (7,5 х 60 мм) образец 1 мл очищенного фактора некроза опухоли из примера 5, содержащий приблизительно 1 мкг протеина и 15600 единиц активности, изокритически элюируют из колонки с гелем со скоростью потока 0,5 мл/мин 0,2 М натрийфосфатным буфером, рН 7,0. Колонку калибруют бычьим сывороточным альбумином (МW66 000), яичным альбумином (MW 45 000), бычьей карбоновой ангидразой В (MW 29 000) и лизоцимом (МW 14300). Получают фракции по 1 мл и проверяют на активность фактора некроза опухоли. Фракции, показывающие активность фактора некроза опухоли, элюируют при молекулярных массах от 45000 до 6000 (фиг.6).

Пример 9

HPLC с обратной фазой

Фактор некроза опухоли также очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией с обратной фазой, используя С4 Синхропак колонку Вотерс Ассосиэйтед, Инк. хроматографической системы. Пики протеинов детектируют при 210 и при 280 нм после элюирования с линейным градиентом от 1 до 23% объем/объем 1-пропанола в 0,1%-ной водной ТФУК в первые 15 мин и 23-30% объем/объем 1-пропанола в 0,1%-ной ТФУК в течение следующих 15 мин при скорости потока 1 мл/мин. Пики проверяют на цитолитическую активность. Органические растворители, применяемые при элюировании фактора некроза опухоли с С4 колонки, снижают активность фактора некроза опухоли примерно на 80% Очищенный по этому способу фактор некроза опухоли высушивают в вакууме, а затем проводят аминокислотный анализ и определение последовательности аминокислот. Результаты представлены на фиг.7. На фиг.7 показано, что фактор некроза опухоли, полученный из элюента примера 5, содержащий биологически неактивные протеиновые загрязнения, элюируется при примерно 16 и 19 мин времени удерживания. Биоактивный элюент из С4-RP-HPLC является по существу гомогенным, по критерию аминоконцевой последовательности.

Пример 10

Определение частичной аминокислотной последовательности для фактора некроза опухоли

Фактор некроза опухоли переваривают трипсином следующим образом: гомогенный фактор некроза опухоли из примера 9 растворяют, сушат и снова растворяют в 100 мМ буфера бикарбоната аммония, рН 8,0, содержащего 5 мас. ТРКС трипсина (Вортингтон Биокемикалс), 1 мМ СаCl2 и 0,01% Твин 20 при соотношении фермента к субстрату 1:20, инкубируют в течение 6 ч при 37oC, прибавляют дополнительные 5 мас. трипсина, и гидролизную смесь затем инкубируют в течение 12 ч при 37oC. Реакционную смесь наносят на С4 НРLC, как описано выше, чтобы разделить пептидные фрагменты. Результаты показаны на фиг.8. Наблюдаются все 9 фрагментов (фрагменты 2 и 2' элюируются вместе в пике, обозначенном Т2 на фиг.8). Полагают, что дополнительный десятый фрагмент не удерживается колонкой. Аминокислотные последовательности для интактного фактора некроза опухоли из примеров 8 и 9 и фрагменты гидролиза трипсином, полученные в этом примере, были проанализированы путем автоматической деградации с использованием модифицированного секвенсера Бекмана модель 890В, снабженного холодными ловушками. Полибрен (1,25 мг) используют в качестве носителя в чашке. Исходя из аминокислотного состава интактной молекулы, молекулярная масса интактного фактора некроза опухоли равна 17000. Эта цифра соответствует данным SDS-ПААГ и подтверждает отсутствие гликозилирования.

Пример 11.

Синергетическое действие фактора некроза опухоли и гамма-интерферона

Клетки murine меланомы В16 (Мэзон Рисерч, Ворсестер, МА), клеточная линия происхождения С57В1/6, высевают на пластины микротитратора 5000 клеток/углубление и инкубируют 4 ч при 37oС в инкубаторе с увлажнением при 5% СО2, перед добавлением лимфокинеза. Фактор некроза опухоли, полученный в примере 1, очищают до практической гомогенности с помощью НРLC и количественно определяют его активность вышеописанной биопробой цитолизиса L-929 клеток. Подобным образом очищенный рекомбинантный гамма-интерферон проверяют на его антивирусную активность против ЕМС-инфенированных L клеток гамма-интерферон, и человеческий фактор некроза опухоли отдельно разбавляют до разбавлений, показанных на фиг. 10. Гамма-интерферон прибавляют сначала в обозначенные углубления, и разбавленный фактор некроза опухоли прибавляют сразу после этого до окончательного объема 0,2 мл/углубление. После окончания 72 ч инкубирования клетки окрашивают 0,5% кристаллическим фиолетовым в 20%-ном метаноле Результаты показаны на фиг.10. В16 являются относительно устойчивым как к фактору некроза опухоли, так и к одному гамма-интерферону, при 1000 единиц/мл фактора некроза опухоли не наблюдается визуально определяемого цитолизиса. Однако добавление количеств гамма-интерферона так мало, например 5 ед/мл, что в результате происходит цитолизис.

Литература

1. R.Macfarlau et.al, 1980, "AJFBaak" 58 (pt 5): 489-500.

2. D.Hannel et.aal, 1980, "Intection and Immunology", 30 (2) 532-530.

3. J.Hammerstron, 1982, "Scand J.Immunol", 15: 311-318.

4. P.Zacharchuk et.al. 1983 "Proc.Naat.Acad.Sci, USA, 80; 6341-6345.

5. Ruff et.al. 1981, Lymphokines, m.2, p.p.235-272, 24-242.

6. S.Green et.al. 1982, "J.Nat.Cancer Inst", 68(6); 997-1003.

7. M.Ruff et.al. 1980, "J.Immunology", 125(4); p.1671-167.

8. H.Oettgen et.al. 1980, "Recent.Result.Cancer.Res", 75; 207-212.

9. F.Kull et.al. 1981, "J.Immunoe", 126 (4)". p.1279-1282.

10. D.Mannol et.al. 1980, "Infection and Immunity", 28 (1); 207-211.

11. N.Matthews et.al. 1980, "Br.J.Cancer", 42, 416-422.

12. S.Green et.al. 1976, "Broc Nat. Acad.Sci. USA", 73 (2) 381-385;

13. N.Satonei et.al. 1981, "Jpn.J.Exp.Mol", 51/6: 317-322.

14. N.Nattnews, 1979, "Br.J.Cancer", 40: 534-539.

15. K.Haranaka et.al. 1981, "Jpn.J.Exp.Med.", 51/3: 191-194;

16. T.Umeda et.al. 1983, "Cellulaar and Molecular Biology", 29(5) 349-352.

17. EP, N100641.

18. Патент SU, N1614765 АЗ, C 12 N 15/00, пуб. 15.12.90. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения фактора некроза опухоли, включающий сбор предварительно индуцированного исходного материала с последующим выделением и очисткой целевого продукта физико-химическими методами, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют клетки человека НL-60 или РВLS, а выделение и очистку осуществляют последовательной хроматографией на стеклянных шариках, быстрой жидкостной белковой хроматографией, полиакриламидным SDS гель-электрофорезом или жидкостной хроматографией при высоком давлении на обратной фазе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при хроматографии на стеклянных шариках элюцию фактора некроза опухоли проводят этиленгликолем.

3. Человеческий фактор некроза опухоли, способный к разрушению или ингибированию опухолевых клеток, полученный из НZ-60 или РВZS-человеческой клеточной линии с аминокислотной последовательностью от положения 1 до положения 157 последовательности, указанной в описании, и имеющий следующие свойства: мол. м. 17000 дальтон (при определении PAGE); изоэлектрическая точка 5,3; специфическая активность 106 ед./мл белка; не гликозилирован.