СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМ КОЖИ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМ КОЖИ


RU (11) 2280483 (13) C2

(51) МПК
A61N 5/10 (2006.01)
A61K 31/17 (2006.01)
G01N 33/537 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004120578/14 
(22) Дата подачи заявки: 2004.07.05 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.07.05 
(43) Дата публикации заявки: 2006.01.10 
(45) Опубликовано: 2006.07.27 
(56) Аналоги изобретения: МОИСЕЕНКО В.М. и др. Определение эффективности и токсичности химиоиммунотерапии больных диссеминированной меланомой кожи. Матер. III ежегодной Росс. онкологич.конф. - СПб., 1999, с.191. RU 2175242 С1, 27.10.2001. RU 2149404 C1, 20.05.2000. HUANG H.Y. et al. Immunohistochemical and ultrastructural comparative study of external lamina structure in 31 cases of cellular, classical, and melanotic schwannomas. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2004 Mar; 12(1):50-8. 
(72) Имя изобретателя: Непомнящая Евгения Марковна (RU); Рубцов Вадим Романович (RU); Петров Семен Венедиктович (RU); Гусарева Марина Александровна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Ростовский научно-исследовательский онкологический институт МЗ РФ (RU); Непомнящая Евгения Марковна (RU); Рубцов Вадим Романович (RU); Петров Семен Венедиктович (RU); Гусарева Марина Александровна (RU) 
(98) Адрес для переписки: 344037, г.Ростов-на-Дону, 14 линия, 63, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт МЗ РФ 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМ КОЖИ
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ позволяет получить высокую клиническую эффективность лечения неоадъювантной аутогемохимиотерапии в сочетании с лучевой терапией меланом кожи за счет установления ведущих морфологических признаков. Проводят морфологическое исследование результатов лечения, при этом в процессе лечения осуществляют иммуногистохимическое исследование уровней экспрессии антигена Ki-67, маркеров к белку-негативному регулятору апоптоза: р53 и Bcl-2 и уровня экспрессии маркера меланомы НМВ-45 и при снижении их уровней по сравнению с показателями нелеченных опухолей определяют лечение как эффективное.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано при оценке эффективности лечения аутогемохимиотерапии (АГХТ) и АГХТ с лучевой терапией больных меланомой кожи.

Известно, что превращение нормальной клетки в опухолевую происходит в результате накопления совокупности ряда мутаций в генетическом аппарате, ведущих к нарушению механизмов, контролирующих размножение и рост клетки (см. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза./Под ред. Ю.Л.Шевченко. - Москва. - Издательский дом "ГЭОТАР - МЕД." - 2004. - 224 с.).

Различные мутации гена Wt p53 - наиболее частое генетическое нарушение, которое находят в раковых опухолях. Несколько исследований посвящено изучению роли иммуногистохимического определения p53 в предсказании клинического течения меланом кожи. Было показано, что повышенная экспрессия p53 в меланоме сопровождается лучшей выживаемостью по сравнению с негативной экспрессией этого мутированного гена-супрессора (медиана выживаемости в первой группе больных была 152,4 месяца против 55,7 месяцев во второй группе).

В практическом плане уровень экспрессии mt p53 может быть прогностическим признаком.

Необходимо подчеркнуть, что эти данные находятся в противоречии со сведениями о прогностическом значении р53 при большинстве других новообразований (рак молочной железы, толстой кишки, легкого и др.), когда повышенная экспрессия этого маркера является свидетельством неблагоприятного исхода заболевания. Для меланом показано резкое снижение выживаемости больных при высокой экспрессии р53 (Loggini В., Rinaldi I., Pigitore R. et al. Immunohistochemical study of 49 cutaneus melanomas: p53, PSNA, Bcl-2 expression and multidrug resistance // Tumopi. - 2001. - Vol.87. - P.179-186).

Известно, что тип роста опухолевой массы представляет очень важную информацию для определения онкологической сущности опухоли и ее агрессивности. В таких случаях показатель пролиферативной активности ее является одним из решающих факторов, учитываемых при выборе тактики лечения (см. Шацева Т.А., Мухина М.С. Антиген Ki-67 в оценке опухолевой пролиферации. Его структура и функция. - Вопросы онкологии. - 2004. - № 2. С.157-164). Переход клетки в состояние покоя должен сопровождаться разрушением или такими структурными изменениями белка, в результате которых он теряет активность и его выявление становится невозможным. Оптимальным маркером пролиферации в этом случае считают антиген Ki-67, который присутствует в клетках практически во всех фазах митотического цикла, исчезает при переходе в период покоя, отсутствует во время репарации ДНК. Антитела к Ki-67 применяют для оценки пролиферативной активности многих новообразований: злокачественных лимфом, опухолей молочной, предстательной, поджелудочной желез, легких, гипофиза, толстой кишки. По отношению числа опухолевых Ki-67-позитивных клеток к общему их количеству рассчитывается индекс пролиферативной активности (индекс Ki-67). Обнаружена связь между значениями индекса Ki-67 и степенью гистологической дифференцировки опухоли и клиническим прогнозом при раке эндометрия, яичника, легкого, мочевого пузыря, опухолях нервной системы. Показано, что индекс Ki-67 является независимым показателем при прогнозировании рецидивов и длительности жизни у больных раком молочной и предстательной желез. Имеющиеся на сегодняшних день результаты свидетельствуют о том, что антиген Ki-67 может быть успешно использован как в оценке пролиферативной активности новообразований, так и в изучении механизмов канцерогенеза.

Однако, не выяснено участие Ki-67 в ремоделировании ядрышка, в организации микротрубочек митотического веретена, в прикреплении хромосом к внутренней поверхности оболочки ядра по завершении клеткой митоза. Функциональное значение многих из этих взаимодействий еще не выяснено. Неизвестно также применение антитела Ki-67 для оценки пролиферативной активности меланомы кожи, прогнозирования рецидивов, длительности жизни больных меланомой кожи.

Известно, что наиболее точными параметрами прогнозирования являются: толщина опухоли (с градациями 1, 2 и 4 мм), возраст, локализация опухоли, пол больного, наличие или отсутствие изъязвления, частота митозов, клеточный тип опухоли (Пожарисский К.М., Кудайбергенова А.Г., Леенман Е.Е. Патоморфологическая характеристика и особенности меланомы кожи. Прогностические факторы. - Практическая онкология. - Меланома. - № 4 (8) (декабрь). 2001. - С.23-29).

Этот источник информации выбран нами в качестве прототипа.

В качестве критерия микростадирования меланомы толщину опухоли измеряют в гистологическом препарате с помощью окулярного микрометра от зернистого слоя эпидермиса до наиболее глубокой точки инвазии. Меланомы тоньше 0,76 мм редко дают метастазы и имеют хороший прогноз. В частности было показано, что 8-летняя выживаемость при меланоме тоньше 0,76 мм составляет 98%. Среди тонких меланом большинство находится в фазе радиального роста, но около 15% из них демонстрируют ранние признаки фазы вертикального роста и соответственно у 10% больных с такими меланомами наблюдаются регионарные метастазы. В настоящее время установлены четкие морфологические критерии двух фаз (радиальной и вертикальной) роста меланомы, резко отличающихся по исходу заболевания, но признаки микростадирования меланом все еще несовершенны и находятся на стадии исследования.

Скорость роста опухоли является важным показателем особенностей ее клинического течения и определяется балансом, пролиферативной активностью и апоптозом, соответствующими специфическими рецепторами. Ни один из многих потенциальных маркеров не получил исчерпывающих доказательств в возможности его практического использования для оценки клинического течения и исхода заболевания, особенно применительно к индивидуальному больному.

Целью изобретения является выявление клинической эффективности и прогностических факторов результатов лечения неоадъювантной АГХТ и АГХТ в сочетании с лучевой терапией больных меланомой кожи.

Поставленная цель достигается тем, что проводят иммуногистохимическое исследование меланомы кожи после неоадъювантной АГХТ с дакарбазином, выявляют на уровне световой микроскопии выраженные признаки патоморфоза опухоли: некробиотические и дистрофические процессы, снижение митотической активности, выраженный фибриллогенез, что свидетельствует о необратимых процессах в меланотических клетках и их гибели, при исследовании меланомы кожи после неоадъювантной АГХТ с дакарбазином в сочетании с лучевой терапией на уровне световой микроскопии выявляют однотипные с вышеизложенными изменения, но с большей степенью выраженности: явления некроза, апоптоза, дистрофических изменений в меланоцитах, увеличение фиброзирования между опухолевыми клетками и в подлежащей ткани, снижение митотической активности. Обнаруженные изменения в клетках свидетельствовали о подавлении опухолевого роста, уменьшении синтеза ДНК; затем проводят на этом же материале после указанного лечения иммуногистохимическое исследование с маркерами факторов пролиферации - Ki-67, апоптоза - р53, bcl-2, НМВ-45, наблюдают экспрессию маркеров в опухолевых клетках, однако отмечается снижение экспрессии маркеров по сравнению с меланомами без неоадъювантной АГХТ с дакарбазином в сочетании с лучевой терапией. Вышеперечисленные ведущие морфологические признаки являются прогностическим фактором эффективности лечения.

Изобретение "Способ определения эффективности противоопухолевого лечения меланом кожи" является новым, так как оно неизвестно из уровня морфологических исследований в онкологии при оценке эффективности противоопухолевого лечения.

Новизна изобретения заключается в том, что авторы проводят иммуногистохимическое исследование, определяют некоторые иммуногистохимические показатели меланомы под воздействием неоадъювантной АГХТ и неоадъювантной АГХТ с лучевой терапией и оценивают результаты и прогноз противоопухолевого лечения. При обоих методах лечения наблюдается снижение экспрессии факторов пролиферации, НМВ-45, факторов апоптоза. На основании данных морфологических исследований по результатам высокоэффективной неоадъювантной АГХТ и АГХТ в сочетании с лучевой терапией были выявлены морфологические показатели, ранее не выявляемые при противоопухолевой терапии, которые констатируют не только эффективность лечения, но и являются благоприятным прогнозом для дальнейшей судьбы больных. Это подтверждается хорошим качеством жизни и выживаемостью больных меланомой кожи.

Физиологическая роль антигена Ki-67 в жизни клетки пока еще не ясна. Однако его присутствие на всех активных фазах митотического цикла позволяет использовать данный белок в качестве универсального маркера пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований. Темп роста опухолевой массы представляет очень важную информацию для определения онкологической сущности опухоли и ее агрессивности. В таких случаях показатель пролиферативной активности ее является одним из решающих факторов, учитываемых при выборе тактики лечения.

Антиген Ki-67 предположительно относят к регуляторным белкам, поскольку их появление совпадает с моментом вступления клетки в митотический цикл и содержание меняется фазозависимо. Ki-67 начинает определяться в ядре с середины G1-фазы. По мере прохождения последующих S-G2 - фаз его количество постепенно нарастает и достигает пика в митозе. По окончании митотического цикла белок быстро катабализируется и перестает выявляться.

Известно, что уровень экспрессии антигена Ki-67 тесно связан с биологически агрессивным поведением опухоли. Выявлена связь между показателем экспрессии PSNA в опухоли и временем прогрессирования заболевания. Отмечена определенная зависимость между уровнем экспрессии молекулярного маркера Bcl-2 в опухоли с ее чувствительностью к адъювантной терапии.

Bcl-2 - маркер к белку - негативному регулятору апоптоза. Повышение уровня экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 часто свидетельствует об усилении роста опухолей, нарастании прогрессии и метастазирования, учащении рецидивов, сокращении сроков жизни больных.

Маркером клеток меланомы является антиген НМВ-45. По отношению к клеткам меланомы антитела к НМВ-45 являются специфическими. НМВ-45 (белок пре- и меланосом) - маркер меланомы.

Изобретение имеет изобретательский уровень, так как для специалиста - врача-морфолога явным образом не следует из уровня медицины в области оценки эффективности противоопухолевого лечения больных меланомы кожи иммуногистохимическим исследованием.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при прогнозировании эффективности противоопухолевого лечения в различных медицинских учреждениях, особенно онкологического профиля, в НИИ онкологии, онкодиспансерах.

Для доказательства полученных результатов морфологического исследования приводим материалы некоторых иммуногистохимических показателей меланом кожи после неоадъювантной АГХТ и АГХТ в сочетании с лучевой терапией, и примеры конкретного выполнения способа на больных.

Следует отметить, что вначале проводилось исследование гистологических препаратов на светооптическом уровне.

Проведенное нами иммуногистохимическое исследование меланом кожи выявило снижение факторов пролиферации Ki-67, апоптоза: р53, bcl-2 и маркера меланомы - НМВ-45. Под действием неоадъювантной АГХТ по сравнению с нелеченными опухолями морфологические признаки факторов пролиферации Ki-67, апоптоза р53, bcl-2 - снижены или отсутствуют; экспрессия маркера меланомы НМВ-45 также снижена.

Под действием неоадъювантной АГХТ в сочетании с лучевой терапией иммуногистохимически были выявлены однотипные изменения, однако степень выраженности их была больше, то есть под действием обоих методов неоадъювантной химиотерапии иммуногистохимическим методом нами были выявлены признаки терапевтического патоморфоза.

Повреждающее действие на меланоциты сводились к некробиотическим и дистрофическим процессам. Снижению митотической активности. Более выраженные процессы наблюдались при неоадъювантной АГХТ в сочетании с лучевой терапией. Отмечено снижение митотической активности (снижение фактора пролиферации Ki-67), уменьшение экспрессии маркера меланомы НМВ-45, маркеров апоптоза (р53, bcl-2).

Неоадъювантную АГХТ осуществляли при меланомах кожи и в сочетании с лучевой терапией в связи с тем, что эта локализация доступна для данного метода воздействия.

Примеры конкретного применения "Способа определения эффективности противоопухолевого лечения меланомы кожи".

Пример № 1

История болезни № 5 901/ж.

Больная О., 1952 г. р., поступила в радиологическое отделение 02.09.03 с диагнозом: Меланома кожи правой голени, St I, гр. 2. Жалобы на наличие пигментного образования на коже правой голени.

Из анамнеза: Болеет около 2-х лет, когда после травмы врожденного пигментного образования на внутренней поверхности верхней трети правой голени заметила рост, кровоточивость. Обратилась в августе 2003 г., была направлена в РНИОИ.

В анамнезе: Беременностей - 5, родов - 2, абортов - 3. Надвлагалищная ампутация матки с шейкой без придатков по поводу лейомиомы 15.05.1990 г. Рак молочной железы st. II. T2N0M 0, гр. 3. Комбинированное лечение в 1998 г. Атрофический гастрит в течение 7 лет.

Локальный статус: на коже внутренней поверхности правой голени имеется экзофитное образование 15 мм, выступает над кожей на 10 мм, темно-коричнего цвета. Кровоточит. Регионарные лимфоузлы не пальпируются.

Ц.а. № 20712-13 - меланома, смешанноклеточный вариант.

УЗИ от 02.09.03 - пигментное образование с признаками малигнизации. В пахово-бедренной области справа не лоцируются.

ФЛО от 08.09.03 - легкие и сердце без патологии.

Специальное лечение:

1. 02.09.03 - АГХТ с дакарбазином 1000,0 мг;

2. Дистанционная гамма-терапия на первичный очаг и пахово-бедренные лимфоузлы справа, РОД=3 Гр (38 Гр);

19.09.03 выполнено широкое иссечение первичного очага с замещением дефекта свободным кожным лоскутом, тренированным методом дерматоэктензии.

Г.а. № 709158-159 - Меланома из эпителиоподобных и невусоподобных клеток. В меланоцитах некробиотические и дистрофические изменения. Кариопикноз, карио- и цитолизис. В дерме, вокруг меланоцитов развитие плотной волокнистой соединительной ткани. Инвазия IV степени по Кларку. Толщина опухоли по Бреслоу - 5 мм.

Проведено иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) с определением следующих маркеров: НМВ-45, р53, bcl-2, Ki-67.

Выявлены следующие изменения. Выраженная картина ослабления реакции с участками полного выпадения экспрессии. Р53 - практически негатив в ядрах меланоцитов. Bcl-2 - отсутствие экспрессии в опухолевых клетках. Ki-67 - очень слабая неравномерная пролиферация меланоцитов. Резкое снижение окрашенных опухолевых клеток, составляющих от 0 до 3%.

Таким образом, под действием проводимой неоадъювантной АГХТ с дакарбазином в сочетании с лучевой терапией, наблюдается выраженный патоморфоз опухоли. Морфологическими особенностями, выявленными иммуногистохимически, являются: снижение факторов пролиферации Ki-67; блокада факторов апоптоза (р53, bcl-2), а также уменьшение экспрессии маркера НМВ-45.

В последующем проведены 3 курса адъювантной АГХТ с дакарбазином в суммарной дозе - 3000,0 мг.

Осмотр в июне 2004 г. Признаков рецидива и метастазов нет.

Пример № 2

История болезни № 16738/р.

Больная Б., 1981 г. р., поступила в радиологическое отделение 10.11.03 с клиническим диагнозом: Меланома кожи нижней трети левой голени, St II, гр.II.

Из анамнеза: Считает себя больной около 1 года, когда заметила рост приобретенного пигментного образования. 8 месяцев назад на фоне беременности отметила бурный рост, изъязвление. После родов появился венчик гиперемии.

Обратилась в 38 недель беременности в ГОД Калмыкии, направлена в РНИОИ. В РНИОИ консультация цитологических препаратов №24553-54 - пигментная меланома.

Консилиум: проф. Рубцова В.Р., Бражниковой Е.И. Рекомендовано отпустить больную с явкой после родов (16.10.03).

Больная явилась 10.11.03, роды - 23.10.03.

Локальный статус: На коже задневнутренней поверхности нижней трети левой голени имеется узловое экзофитное пигментное образование, темно-бурого цвета, асимметричное с нечеткими контурами, венчиком гиперемии, с изъязвлением, кровоточит самостоятельно, имеются выделения с неприятным запахом, размеры 4×2,7×0,9 см.

Пальпируется паховый лимфоузел слева до 1,5 см, плотный, подвижный, безболезненный.

Обследование:

ЭКГ от 13.11.03 - неполная блокада правой ножки пучка Гисса.

ФЛО от 12.11.03 - данных за поражение легких не выявлено.

УЗИ от 14.11.03 - хронический холецистит, поражение паховых лимфоузлов слева (в паховой области слева увеличенные лимфоузлы до 1,5 см в диаметре).

Узи-томограмма от 11.11.03 (до лечения):

Пигментное новообразование, расположенное по внутренней поверхности левой голени представлено гипоэхогенным кожным образованием размерами 21,1×7,9×21,3 мм. При ЦДК, ЭДК гиперинтенсивный периферический и центральный кровоток артериального типа. PSU от 7 до 11 м/с, при ЗD-ангиосонотомографии инфильтрация внутренней поверхности кожи с распространеннием до верхнего слоя подкожно-мышечной клетчатки.

Заключение: Меланома кожи левой голени с вторичными воспалительными изменениями.

УЗИ-томограмма от 18.11.03 (после АГХТ) - Новообразование кожи левой голени размерами 21,3×8×17 мм, эхо-структура неоднородная. Количество сосудов по периферии и в центре - без существенной динамики. Скорость кровотока в опухоли и по периферии выше (по сравнению с данными от 11.11.03). В левой паховой области одиночный лимфоузел 15×6 мм.

Заключение: Меланома кожи (незначительное уменьшение размеров); параметры опухолевой гемодинамики - без изменений (прогноз неблагоприятный).

Проведена неоадъювантная терапия, включавшая:

1) с 11.11.03 и 15.11.03 - неоадъювантная АГХТ с дакарбазином 1000,0 мг. Без побочных явлений;

2) с 18.11.03 по 02.11.03 дистанционная гамма-терапия на первичный очаг с 2-х тангенциальных полей и на левую паховую область, РОД=3 Гр, СОД составила по 38 Гр без лучевой реакции.

Диагноз: Меланома кожи левой голени. St. III, гр. II, метастазы в левые паховые лимфоузлы. Состояние после химиолучевого лечения.

02.12.03 выполнено широкое иссечение первичного очага меланомы кожи левой голени с пластикой свободным кожным лоскутом. Пахово-бедренная лимфаденэктомия слева. Заживление первичным натяжение. Швы сняты на 14-е сутки.

Г.а. № 719465-466: Меланома из эпителиоподобных и невусоподобных клеток с изъязвлением, воспалением. В меланоцитах выраженные некробиотические и дистрофические процессы. Незначительный фиброз в дерме. В некоторых клетках - признаки апоптоза. Инвазия IV-V уровня по Кларку. Толщина опухоли по Бреслоу - более 10 мм. В лимфатическом узле - метастазы меланомы.

Проведено ИГХИ опухоли со следующими маркерами: НМВ-45, р53, bcl-2, Ki-67. Обнаружены следующие изменения. НМВ-45 - яркая неравномерная реакция опухоли с участками выпадения экспрессии. Р53 - яркий позитив в 15-20% меланоцитов. Bcl-2 - позитивная отчетливая реакция в опухоли, однако на отдельных участках отмечается отчетливая негативная реакция. Ki-67 - положительная неравномерная реакция в 5-20% ядер меланоцитов. В центре среза в участке с негативом по НМВ-45 отмечено полное отсутствие пролиферации.

Таким образом, под действием проводимой неоадъювантной АГХТ с дакарбазином в сочетании с лучевой терапией наблюдается выраженный патоморфоз опухоли. Морфологическими особенностями, выявленными иммунногистохимически, являются: снижение фактора пролиферации Ki-67 (т.е. подавление митотической активности); блокада факторов апоптоза (р53 и bcl-2), а также уменьшение экспрессии маркера НМВ-45.

Поставлен диагноз: Меланома кожи левой голени, рТ4N2М0, st. III, гр. III. метастазы в левые паховые лимфоузлы. Состояние после комплексного лечения.

В последующем проведены 3 курса адъювантной АГХТ с дакарбазином в суммарной дозе 3000,0 мг.

Осмотр в мае 2004 г. Признаков рецидива и метастазов не определяется.

Технико-экономическая эффективность изобретения "Способ определения эффективности противоопухолевого лечения меланомы кожи" заключается в том, что на основании морфологического исследования некоторых иммуногистохимических маркеров, выявлена высокая клиническая эффективность новых способов лечения меланомы кожи неоадъювантной АГХТ в сочетании с лучевой терапией, ранее не выявлявшиеся морфологическим исследованием.

На основании выявленных ведущих морфологических признаков стало возможным установить положительные прогностические результаты лечения.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ определения эффективности лечения неоадъювантной аутогемохимиотерапии в сочетании с лучевой терапией меланом кожи, включающий морфологическое исследование результатов лечения, отличающийся тем, что проводят в процессе лечения иммуногистохимическое исследование уровней экспрессии антигена Ki-67, маркеров к белку-негативному регулятору апоптоза: р53 и Bcl-2 и уровня экспрессии маркера меланомы НМВ-45 и при снижении их уровней по сравнению с показателями нелеченных опухолей определяют лечение как эффективное.