СПОСОБ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

СПОСОБ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ


RU (11) 2074719 (13) C1

(51) 6 A61K31/41 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.03.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 4895765/13 
(22) Дата подачи заявки: 1989.12.08 
(31) Номер конвенционной заявки: 285151 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1988.12.12 
(33) Страна приоритета: US 
(31) Номер конвенционной заявки: 335007 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1989.04.07 
(33) Страна приоритета: US 
(45) Опубликовано: 1997.03.10 
(56) Аналоги изобретения: Wakabayashi et al. J.Pestide Sci, 1986, p. 635-460. Photochemistry and Photobidogy, 1987, v.46, N 5. 
(71) Имя заявителя: ФМК Корпорейшн (US) 
(72) Имя изобретателя: Блейк Филлип Холлинг[US]; Дебра Эн Витковски[US] 
(73) Имя патентообладателя: ФМК Корпорейшн (US) 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 89/05599 (08.12.89) 

(54) СПОСОБ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ 

Сущность изобретения: клетки опухоли молочной железы в присутствии порфирина обрабатывают светом и специфическим ингибитором энзиматического превращения протопорфириногена в протопорфирин IX под действием протопорфирин-оксидазы, при этом используется фармацевтическая композиция, содержащая специфический ингибитор ферментативного превращения протопорфириногена в протопорфирин IX протопорфирин-оксидазой, имеющей показатель I50 для протопорфирин-оксидазы менее 1 мкм или обладающей отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом более, чем -500 Мв. 2 с. и 9 з.п. ф-лы, 6 табл. 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение (один из аспектов) касается фотодинамического лечения молочной железы с опухолевыми клетками, как это делается при фотодинамическом излечении рака.

Известен метод введения производного гематопорфирина или смеси порфиринов, являющихся производными данного соединения, например, введение препарата "фотофрин II" (Photofrin II) в опухолевые клетки молочной железы с последующим воздействием на эти клетки светового излучения определенной длины волны с целью вызвать разрушение клеток. Данному методу фотодинамической терапии посвящена серия статей, составляющих специальный выпуск журнала Photochemistry and Photobiology, 1987, т. 46, N 5 (ниже принято сокращение P P 46 5). В этих статьях показано, что фотодинамическая терапия нашла широкое применение при лечении различных раковых заболеваний (в т.ч. рака бронхов, мочевого пузыря, пищевода, легких, кожи, органов головы и шеи, мозга, толстой кишки, а также внутриглазных и гинекологических раковых заболеваний). Утверждается, что биохимические эффекты упомянутой порфириновой фотосенсибилизации включают образование поперечных связей протеинами и в мембранах, пероксидирование липидов, подавление переноса некоторых важных метаболитов, лизис лизосомальных (lysosomal) и митохондриальных оболочек, подавление активности ряда энзимов и повышение усвоения порфиринов клетками (P P 46-5, с. 695). Порфириновый препарат вводят как правило путем инъекций (например, внутривенно или в брюшную полость); типичная доза составляет 2 мг препарата "фотофрин" на 1 кг массы тела.

Кроме того, порфириновый препарат можно включить в липосому и ввести инъекцией (например, в брюшную полость) как это указано, в частности, в статью Спайкса (Spikos) и др. "Фотодинамическое поведение порфиринов в модельных клеточных, тканевых и опухолевых системах" (Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor System) в сборнике "Фотодинамическая терапия опухолей и двух заболеваний (Photodynamic Therapy of Tamor and other Diceases), вышедшем под редакцией Йори (Jori) и Перриа (Perria); Падуя, изд. Libreria Progretto 1985, с. 45 53, а также в упомянутом выше спецвыпуске.

В специальной литературе говорится о том, что введение фотопорфирина в такие клетки, как, например, эритроциты человека или murine клетки при лейкемии, дает заметный фотосенсибилизирующий эффект, см. соответственно: Даббелмен (Dubbleman) и др. Biochimica et Biophysica Acta, 1978, т. 511, с. 141 151; Кессель (Kessel), (Cancer Research) 1982, т. 42, N 5, с. 1703 - 1706. В статье Кесселя утверждается, что из всех испытанных фотосенсибилизирующих реагентов фотопорфирин наиболее активный. Однако когда Кессель и другие исследователи, например, Беренбаум (Berenbaum) и сотр. (см. Br. J. Cancer, 1982, т. 45, с. 571 581) делали инъекции фотопорфирина животным, заметного содержания фотопорфирина в опухолях не было обнаружено, что свидетельствует о возможном быстром уносе фотопорфирина, введенного в организм подобным образом, вследствие кровообращения.

Также хорошо известно применение производного гематопорфирина и аналогичных препаратов для диагностирования и локализации опухолей, таких как рак мочевого пузыря или легких (см. например: P P 46 5, с. 759).

Активное соединение, применяющееся согласно одному из аспектов настоящего изобретения для лечения клеток в рассматриваемой фотодинамической терапии или в известных методах диагностирования и локализации опухолей, представляет собой не порфирин или же не только порфирин.

В отличие от просто порфирина данное соединение ингибирует энзиматическое прекращение фотопорфириногена в структуре heme упомянутых клеток, вызывая тем самым образование эндогенного фотопорфирина IX в этих клетках. Авторы установили, что такие реагенты, как некоторые виды гербицидных соединений, которые подавляют энзиматическое превращение порфириногенов в хлорофилл в растительных клетках, также подавляют и энзиматическое превращение порфириногена в структуре heme клеток молочной железы. Авторы считают: упомянутое ингибирование этими реагентами, вероятно, влияет на стадию превращения фотопорфириногена в фотопорфирин IX под действием энзима (фотопорфириноген-оксидаза, ЕС 1.2.3.4) таким образом, что фотопорфириноген уже не претерпевает энзимного превращения в фотопорфирин IX нормальным путем, а вместо этого испытывает внутриклеточное окисление (например, в плазме) вне нормального энзиматического процесса (например, все оболочки органеллы), вследствие чего фотопорфирин IX накапливается в областях, где он недоступен для нормального превращения в heme, и в результате при облучении клеток светом накопившийся таким образом фотопорфирин IX вызывает эффект разрушения клеток, подобный тому, который наблюдался в случае описанной выше фотодинамической терапии.

Отвечающие настоящему изобретению активные соединения, подавляющие энзимы, являются специфическими ингибиторами фотопорфириноген-оксидазы в том смысле, что они не функционируют как обычные энзимные яды подобно реагентам, вызывающим денатурирование или образование поперечных связей (например, подобное реагентам на основе сульфигидрила); они также не являются прежде всего такими влияющими на условия окисления препаратами, как акцепторы электронов, и, следовательно, активные соединения, предпочтительные согласно настоящему изобретению, имеют более отрицательный окислительно-восстановительный потенциал, чем 500 мВ и даже еще отрицательный окислительно-восстановительный потенциал, чем 500 мВ и даже еще отрицательный, а именно, равный 800 мВ (измеренный, например, обычным методом в подходящем для данного соединения растворителе: методом циклической вольтаметрии или же полярографическим методом). Предпочтительно также, что активное соединение не представляет собой тетрапиррол и что его показатель I50 для фотопорфироген-оксидазы составляет менее 1 мкМ, например, менее 0,3 мкМ; в частности показатель I50 составляет приблизительно 0,1, 0,03 или 0,01 мкМ даже менее.

Предпочтительно такое ингибирующее энзим активное соединение, которое отличается повышенной способностью разрушения плазмалеммы (Plasmalemma) растительных препаратов. Один из методов испытания данной способности описан под названием "Эксперимент по вымыванию) в статье Холлинга и Питерса (Halling and Peters); Plant Physiology, 1987, т. 84, с. 1114-6.

Согласно этому испытанию (более подробно оно описано ниже в приложении А) предпочтительные реагенты показывают по крайней мере 50%-ное общее вымывание при уровне обработки 100 мкМ, предпочтительно же при уровне обработки 1 мкМ и менее, например, при 100 нМ. Высокоактивные препараты, такие как 1-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3-метил-4-дифторметил-<IMG SRC="http://www.fips.ru/chr/916.gif" ALIGN=ABSMIDDLE>2-1,2,4-триазолин-5-он или лактофен (см. ниже) показывают общее вымывание свыше 90% при концентрации 100 нМ.

Другой методикой определения способности препарата разрушать плазмалемму растительного вещества является т.н. "Испытание на ингибирование позеленения, вызываемого световым облучением", подробнее описанное ниже в Приложении В. Эта методика предназначена для определения способности препарата подавлять позеленение отбеленной в темноте культуры микроорганизмов Clamydomonas reinhardi, y-1 (разновидность микроорганизмов aglae, которые растут в темноте, не образуя хлорофилла). При этом имеется в виду, что масса algae отбеливается благодаря наличию в ней свежих, непозеленевших клеток, но вновь образует хлорофилл на свету.

Многие из предпочтительных активных соединений, применяющихся согласно настоящему изобретению, способны подавлять позеленение, вызванное световым облучением, по крайней мере на 50% при концентрации используемого соединения 10-5 М, предпочтительное при 10-6 и менее, например, при концентрации 10-7 М. Кроме того, это соединение должно быть таким, которое в ходе указанного испытания на ингибирование позеленения образует всплывающий на поверхность продукт с максимумом светопоглощения при 405 нМ, что превышает максимум для хлорофилла, составляющий в данном системе 669 нМ; например, всплывающий продукт показывает при 405 нМ максимум, который в 2,3 или 4 раза выше максимума при 668 нМ.

Среди ингибирующих энзимы активных соединений, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, есть гербициды следующих типов (А-D).

А. Арил-гетероциклические гербициды общей формулы:

Ph NHet

Ph замещенный фенил, предпочтительно 2,4-дизамещенный фенил, еще предпочтительнее 2,4,5 тризамещенный фенил, а NHet 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо (с 1 4 атомами азота в кольце) формулы:



где Q означает замыкающую группу гетероциклического кольца, а R водород или замещающую его группу. Данный класс соединений включает также препараты, которые в статье Вакабаяси (Wakabayshi) и др. (см. J. Pesticide, Sci. 1986, т. II, с. 635 460) определены как класс гербицидов на основе циклических имидов, причем на с. I этой статьи представлены следующие соединения:



Соединение I представляет собой гербицид на основе арил-оксидиазола, а именно 2-трет. -бутил-4-(2,4-дихлор-5-изопропоксифенил)-2-1,3,4-оксидиазолин-5-он. Другие 2-алкил-4-(2,4,5-тризамещенный фенил)-2-1,3,4-оксидиазолин-5-оны, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, охарактеризованы, например, в патентах США N 3385862, 3836539, 3876413.

Соединение II представляет собой гербицид на основе арил-тетрагидроиндазола, а именно 3-хлор-2-(4-хлор-2-фтор-5-изопропоксифенил)-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазола.

Соединения III, IV и V представляют собой гербициды на основе арил-тетрагидрофталимида. Другие арил-тетрагидрофталимиды, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, охарактеризованы, например, в патентах США N 4431822, 4670046, 4670042, 4439229, а также в выложенной международной заявке N WO 87/07062. В двух последних источниках, кроме того, описаны другие NHet кольца, использование которых также допустимо. Примеры таких колец приведены в частности на с. 12 14 международной заявки N WO 87/07602, а также в патенте США N 4439229 (cо строки 25 на с. 4 по строку 20 на с. 5).

Другими подходящими гербицидами типа Р NHet являются:

арил-триалиноны, такие, что описаны в патентах США под номерами 4318731, 4398943, 4404019, 4702945, 4705557, 4702763, 4761174, а также в международных заявках под номерами WO 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730, WO 87/03782, и WO 86/04481 и WO 88/01133;

арил-тетразолиноны, такие, что описаны в патенте США под номером 4734124, а также в международных заявках под номерами NN WO 85/01939 и WO 87/03873;

арил-триазиндионы, такие, что описаны в патентах США под номерами NN 4755217 и 4766233, а также в международной заявке N WO 86/00072;

арил-гидантоины, такие, что описан в патенте США под номером 4427438;

арил-уразолы, такие, что описан в патенте США N 4452981 и арил-гексагидропиридазины, такие, что описан в патенте США N 4619687.

В. Арил-гетероциклические уретаны, такие, что описан в патенте США N 4521242.

С. Гербициды на основе простого фенилового эфира из тех, что имеют пара-гало- или пара-нитро-феноксифениловую структуру, а именно, такие, как следующие имеющиеся в продаже препараты:

5-[2-хлор-4-(трифторметил)-фенокси] -2-нитро-N-метансульфонилбензамид ("фомесафен")



Метил-5-(2,4-дихлорфенокси)-2-нитробензоат ("Бифенокс")



5-(2-(2-хлор-4-(трифторметил)-фенокси)-2-нитробензоат натрия ("Ацифлуоросфен")



2-хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-трифторметилбензол ("Оксифлуорфен")



Другими подходящими и имеющимися в продаже гербицидами на основе простых дифениловых эфиров являются следующие соединения.

"Лактофен": 1-(карбоэтокси)-этил-5%(2-хлор-4-трифторметил-фенокси)-2-нитробензоат;

"Флюороглюкофен": (карбоэтокси)-метил-5-(2-хлор-4-трифторметилфенокси)-2-нитробензоат;

"Фромесофен": 5-[2-хлор-4-(трифторметил)-фенокси]-N-метил-сульфонил-2-нитробензамид;

"Хлоронитрофен": 2,4,6-трихлор-(4-нитрофенокси)-бензол;

"Хлородифен": 2-нитро-1-(4-нитрофенокси)-4-трифторметил-бензол;

"Нитрофен": 2,4-дихлор-1-(4-нитрофенокси)-бензол;

"Хлометоксифен";

4-(2,4-дихлорфенокси)-2-метокси-1-нитробензол.

Кроме того, еще одним подходящим простым дифениловым эфиром является оксим-О-ацетат 5-(2-хлор-4-трифторметилфенокси)-2-нитроацетофенона.

1. Гербициды на основе арил-пиразолов, таких, что описаны в патентах США NN 4563210, 4496390 и 4459150, а также в выложенной заявке Германии N 3530327 А1.



где хb кислород или сера, а Рh имеет смысл, указанный выше; данные соединения описаны в Европейской патентной заявке под N 273417, а также в каталоге Derwtnt Abstracts (см. N 87-040749).

Лечение активными соединениями, отвечающими настоящему изобретению, можно осуществлять посредством инъекций как внутривенно, так и в брюшную полость. Активное соединение можно использовать в виде стерильной композиции, представляющей собой реагент, растворенный или диспергированный в фармацевтически приемлемом носителе, например, в водном изотоническом растворе, таком как соленая вода (0,9% NaCl) или же подсоленый буферный раствор Далбекко (Dulbecco) c концентрацией порядка 2,5 мг/мл. Или же активное соединение может быть включено в липосомальную систему, такую, что можно получить в фосфолипидной среде аналогично тому, как это описано на с. 1659 - 1660 справочника Kemington,s Pharmacentical Science, 17-е издание фирмы "Мак паблишинг Кo" (Mack Publishing Co). Например, аналогично рецептуре, которую описали Йори и сотр. (см. Br. J. Cancer, 1983, т. 48, с. 307), можно растворить 51,6 мг дипальмитоилдифосфатидилхолина в 10 мл 1 мМ раствора реагента в смеси хлороформа с метиловым спиртом (объемное соотношение 9:1) c последующим удалением растворителя (после предварительного тщательного перемешивания) под вакуумом при 30oC, получая в результате твердое вещество, которое можно вновь перевести во взвешенное состояние в 10 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора с величиной рН 7,4, содержащего 150 мМ NaCl, c последующей ультразвуковой обработкой замутненного раствора при 50oС в течение 30 мин.

Ингибирующие энзимы реагенты, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, допускается соединять или связывать с подходящими моноклональными антителами, специфически воздействующими на опухоли (МАВs), с использованием техники связывания, хорошо известной специалистам в данной области в качестве средства доставки реагента, ингибирующего энзимы, к конкретному участку, пораженному опухолью.

Ингибирующие энзимы активные соединения, применяющиеся согласно настоящему изобретению, можно также вводить простым назначением путем глотания, предпочтительно в разбавленном виде вместе с фармацевтически приемлемым носителем, в также посредством добавления их к пище, как это показано ниже в примере 6.

Желательно, в особенности при назначении препарата через глотание, применять ингибирующие энзимы реагенты, представляющие собой растворимые в воде соли или же кислотные соединения, образующие растворимые в воде соли натрия или калия, то-есть такие, как сульфамид того вида, который описан в Международных заявках N WO 87/037873 (например, реагент бс в приведенном ниже примере 6), а также N WO 85/001939, N WO 87/037873 или его водорастворимая соль, либо соответствующая карбоновая кислота или ее водорастворимая соль, например, натриевая соль, известная под названием "Ацифлуорфен".

Допускается включение ингибирующих экзимы активных соединений, используемых согласно настоящему изобретению, в обычные фармацевтические препараты, такие как таблетки (например, прессованные таблетки, на которые можно нанести сахарную пасту и/или сироп), свечи, капсулы (например, твердые желатиновые капсулы), суспензии, растворы, порошки или ампулы. В таких препаратах активный компонент может находиться в смеси с фармацевтически приемлемым твердым или жидким носителем, который по желанию может быть пищевым продуктом. Например, это может быть твердый продукт, быть пищевым продуктом. Например, это может быть твердый продукт, такой как кукурузный крахмал, или жидкий разбавитель, такой как вода или пищевое либо минеральное масло, или же растворитель диметилсульфоксид и т.п. Можно применять смеси ингибирующих энзимы активных компонентов, например, смесь активного компонента 6с, указанного ниже в примере 6, с "Ацифлуорфеном", в приблизительно равных количествах. Назначаемую дозировку можно определить обычным экспериментальным путем, хорошо известным специалистам в данной области, по методике эксперимента, описанной для препарата "фотофрин" (Photophcin) в статье Даферти "фотодинамическая терапия (ФДТ) злокачественных опухолей", см. СRC Сritical Reirews в издании Oncology/Hemotology, 1984, т. 2, вып. 2, с. 83 116.

Ниже с целью иллюстрирования настоящего изобретения приведены следующие примеры.

П р и м е р 1. Клетки НеLа (линия опухолевых клеток человека, обычно используемых при исследовании опухолей, выведенная из банка культур American Type Cneture Collection), находящиеся в фазе логарифмического роста (выращенные при 37oС в течение 5 сут в однолитровых фальконовских колбах для тканевых культур) подвергали промывке в солевом фосфатном буферном растворе (СФБР). Далее к ним добавляли 0,25%-ный раствор трипсина в 2 мл СФБР. Через несколько минут препарат осторожно извлекали из колбы и помещали в стакан, содержащий 100 мл 25 мМ раствора HEPES в "минимальном эфирном носителе" (Minimum Essential Medium) с добавлением к МЕМ 10% (сб.доли) неактивированной телячьей сыворотки. 1,1 мл 200 мМ раствора глутамина в 0,85%-ном солевом растворе, а также 11000 единиц пенициллина на 11000 мкг стрептомицина.

Полученную в результате клеточную культуру, вновь переведенную во взвешенное состояние, помещали порциями по 5,0 мл в фальконовские колбы для тканевых культур вместимостью 50 мл и (за исключением контрольной пробы) смешивали с лекарственным активным соединением. Указанные порции далее выдерживали в темноте при 37oС в течение 3 сут. После этого культуру клеток извлекали и подвергали экстрагированию при зеленом свете следующим образом.

Клетки поднимали со дна колб добавлением по 0,8 мл 0,25%-ного раствора трипсина в СФБР. После инкубационного выращивания в темноте в течение 1 ч клетки и среду извлекали из колб, помещали в круглодонные пробирки для центрифугирования и подвергали двум циклам замораживания оттаивания с целью разрушения клеток и обеспечения возможности экстрагирования.

Исследование клеточных взвесей после данной разрушающей операции не выявило неповрежденных клеток. Затем в каждую пробирку добавляли по 10 мл ацетона со свойствами основания (90% ацетона 10% 0,1Н NH OH), после чего пробирки подвергали центрифугированию для удаления протеина и кусочков клеток. Во всплывающее на поверхность вещество добавляли по 50 мл воды, а затем по 0,5 мл насыщенного водного раствора NaCl. Далее регулировали рН до величины 6,8 введением по каплям 2 М раствора KH2PO4. Затем заполняли колонку типа С8 BakerPrep ацетоно-водным экстрактом. Колонки просушивали и каждую промывали 2 мл воды. Тетранирролы вымывали смесью СН4OH:H2O при соотношении 90 10, взятой в объемном количестве 2 х 1,5 мл. После этого экстракты были подвергнуты количественному определению на спектрофлуорометре.

В рассматриваемом эксперименте были использованы следующие лекарственные активные соединения.

А. 5-аминолевулиновая кислота, известная как промежуточный продукт при синтезе тепрапирролов.

Активное соединение А было поставлено в виде стерилизованного фильтрованием А было поставлено в виде стерилизованного фильтрованием 250 мМ водного раствора (рН 6,5). Активные соединения В, С, I и Е были поставлены в виде 50 мМ раствора в ацетоне. Ацетон добавляли также в контрольную пробу, с тем чтобы концентрация в ней составила 0,2% (об. доли). В клеточные культуры вводили такие количества указанных активных компонентов, которые обеспечивали бы концентрации, приведенные ниже в табл. 1. В этой же таблице представлены количества полученного протопорфирина IX тетрапиррола (Proto IX).



П р и м е р 2. Клетки Нe La в логарифмической фазе роста выращивали в течение 6 сут. в шести однолитровых фальконовских колбах для тканевых культур при 37oС, после чего промывали фосфатным буферным солевым раствором (ФБСР). Далее туда добавляли 0,25% -ный раствор трипсина в СФБР и через несколько минут клетки осторожно извлекали и помещали в стаканы, содержащие по 110 мл 25 мМ раствора HEPES в минимально-эфирной среде (МЕМ) с добавлением 10% (об. доли) неактивированной телячьей сыворотки, 1,1 мл 200 мМ раствора глутамина в 0,85% солевом растворе, а также 11 000 единиц пенициллина на 11 000 мкг стрептомицина.

Культуру клеток, вновь переведенную во взвешенное состояние, помещали равными порциями по 5,0 мл каждая во фальконовские колбы для тканевых культур вместимостью по 50 мл содержащие, либо не содержащие гербицид, и проводили инкубационную обработку в темноте при 37oС в течение 4 сут причем аналогично примеру 1 гербицид вводили в разбавленный ацетоновый раствор. Ацетон также добавляли и контрольным пробам для обеспечения в них концентрации ацетона 0,2% (сб. доли). Количество гербицида было таким, чтобы обеспечить концентрации, указанные ниже в табл. 2.

Для обработки использовали следующие активные компоненты:

В. Как в примере 1

С. Как в примере 1

F. Гербицид формулы:



Экстрагирование проводили следующим образом. Среду из каждой колбы помещали в стеклянные круглодонные пробирки, причем клетки, прилипшие к донцам фальконовских колб освобождали добавлением 0,5 мл 0,25% -ного раствора трипсина в СФБР и после выдерживания в течение нескольких минут при 37oС указанную культуру клеток сливали из колб и воссоединяли с клеточной средой.

Далее от каждой клеточной суспензии отбирали равные порции по 100 мкл с целью определения плотности клеточной культуры. Оставшиеся 5,4 мл суспензии клеточной культуры далее были подвергнуты ультразвуковой обработке в течение 30 мин для разрушения клеток.

Затем в каждую пробирку вводили по 10 мл ацетона с основной реакцией (90% ацетона 10% NH4OH), после чего пробирки подвергали центрифугированию с целью удаления протеина и обрывков клеточной ткани. Во всплывающее на поверхность вещество добавляли 5 мл воды, а затем 0,5 мл насыщенного водного раствора NaCl. После этого величину рН добавляли до 6,8, добавляя по каплям 2 М раствор КН2РО4.

Далее продукт экстрагировали из среды вода-ацетон, загружая в колонку С8 Вакер Р ер. Колонку сначала подсушивали, а затем 3 мл смеси метилового спирта с водой (90 10). Аналогично примеру 1 все упомянутые операции экстрагирования были проведены в условиях, по существу полностью исключающих возбуждение протопорфирина IX под действием света, а именно, при зеленом свете или в темноте, например, в сосудах с белым покрытием. Затем на спектрофлуорометре СРЕХ определяли параметры флуоресценции экстрактов. Количественные показатели накопления пропорпорфирина (Proto IX) устанавливали при помощи найденных заранее коэффициентов затухания. Результаты представлены ниже в табл. 2.

Другой аспект настоящего изобретения касается получения протопорфирина IX (ниже Proto IX). В соответствии с этим осуществляли гетеротрофическое выращивание микроорганизмов algaе относящихся к классу эвкариотов, в темноте (или же при освещении, не вызывающем возбуждения Proto IX) в среде, содержащей описанное выше активное соединение, ингибирующее энзиматическое превращение протопорфириногена в Proto IX. Среду или микроорганизмы algae, или же и то и другое вместе далее обрабатывали с целью экстрагирования Proto IX и его отделения от хлорофилла, каротиноидов, обрывкой клеточных тканей и т.п. Разделение можно осуществлять любым обычным способом, например, посредством жидкофазной хроматографии, включая жидкостную хроматографию с обращением фазы, или же посредством растворения растворителем, а также осаждением Proto IX путем его перевода в хелатное соединение с металлом, например, железом, цинком или магнием с последующим (по желанию) регенерированием Proto IX, как это делается по известной методике обработки хелата разбавленной кислотой.

Операции на всех стадиях разделения проводят при освещении, не вызывающем возбуждения Proto IX, например, при зеленом свете, как это описано в приложении А, озаглавленном "Обработка в темноте", или же в полной темноте. Хелат железа нечувствителен к свету, так что работа на свету при использовании этого соединения допустима в большей степени.

Микроорганизмы algaе предпочтительнее выращивать в виде суспензии клеточной культуры при температурах 15 30oC. Концентрация ингибирующего активного соединения может, например, составлять от 10-5 до 10-7 М. Примерами приемлемых микроорганизмов algae являются: Scenedesmus sp. Chlamydomonas reinhardi, Englena sp. Bumilleriopsis diliformis

П р и м е р 3. Культуры микроорганизма Clamydomonas reinhardi (дикая разновидность) выращивали в резервуаре из нержавеющей стали, вмещающем, например, 300 л с использованием описанной ниже культивационной среды (табл.А). К культуре добавляли раствор 1-(карбоэтокси)-этил-5-(2-хлор-4-трифторметилфенокси)-2-нитробензоата (т.н. "Лактофан") технический фенилэфирный гербицид) в ацетоне с целью обеспечения концентрации активного компонента 10-5 М и конечной концентрации ацетона, равной 0,1% Смесь оставляли в покое для выращивания в ней микроорганизмов при 25oС на 4 7 сут при осторожном механическом перемешивании и/или аэрировании.

Продолжая выполнять операции в темноте, содержимое резервуара отфильтровывали, фильтрат подвергали анализу на предмет обнаружения в нем протопорфирина IX.

Один из методов анализа с целью обнаружения фотопорфирина IX заключался в фильтровании содержимого реакционного резервуара (находящегося все это время в темноте) и в добавлении ацетона к фильтрату. Затем данную смесь подвергали экстрагированию петролейным эфиром. После этого водно-ацетоновую среду подвергали экстрагированию диэтиловым эфиром, который потом удаляли из осадка выпариванием. Этот осадок растворяли в метиловом спирте и подвергали хроматографии с обращением фазы с целью получения фотопорфирина IX. Кроме того, возможно было применение и методики обнаружения данного соединения, описанной в примерах 1 и 2.

Альтернативой применению микроорганизмов Clamydomonas reinhardi является применение культуры Scendesmus sp. выращенной на вышеуказанной среде, в которой ацетат натрия заменен глюкозой.

П р и м е р 4. Данный пример аналогичен примеру 3 за исключением того, что вместо "Лактофена" применяют 1-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3-метил-4-дифторметил-<IMG SRC="http://www.fips.ru/chr/916.gif" ALIGN=ABSMIDDLE>2-1,2,4-триазолин-5-он.

П р и м е р 5. Определение показателя I50

Протопорфириноген IX (Протоген IX)

Поставщиком препарата Proto IX была фирма "Порфирин продактс" (Porphyrin Products), г. Логэн, шт. Юта, США. Этот препарат выделили в чистом виде и описали Фюслер и сотр. (Т.Р. Fuesler et al. Plant Physiol, 1981, т. 67, с. 246 249). Свежий протоген IX получали восстановлением Proto IX с использованием Na/H амальгамы, как это описали Джекобс и Джакобс (N.J. Jacobs and J. M. Jacobs: Enzyme, 1982, т. 28, с. 206 219), работавшие с очищенным Proto IX с концентрацией 300 мкмМ.

Растительный материал

Огуречную рассаду (Cacumis saturis L. сорт Wisconsin SMR18) выращивали в затемненной рассадной камере на вермикулите, смоченном жидким фирменным удобрением (9-45-15). Рассаду выращивали при 25oС и при относительной влажности воздуха 80 90% Рассаду освещали прерывистым светом дозированной интенсивности 25 мк Е/м2.c (РAR) от управляемого электронным таймером источника света Bright Stick фирмы "Дженерал Электрик" из расчета I мин освещения в течение 60-минутного цикла. Таким образом была получена растительная ткань, обладающая способностью ускоренного синтеза хлорофилла при сведении к минимуму количеств резервного крахмала и уровней первоначального хлорофилла.

Изолирование хлоропластов

Выделяющиеся хлоропласты были изолированы методом, который описали Фюслер (Т. Р. Fuesler) и сотр. (см. Plant Physiol. 1984, т. 75, с. 662 664) за исключением того, что на конечной стадии очистки пластициды центрифугировали через 40%-ную (об. доли), а не через 45%-ную прокладку из материала Pe r co II. Затем хлоропласты были вновь переведены во взвешенное состояние в буферном растворе для проб, содержащем 0,5 М маннитола, 20 мкМ TES, 10 мкМ HEPES, 1 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 1 мкМ мg Cl2, 1% (масс/объем) альбумина бычьей сыворотки и 1 мкМ дитиоэритритола при рН 7,7 и итоговом содержании протеина 2 мг/л.

Пробы протопорфириноген-оксидазы

Пробы были выведены так, что это описали Джакобс и Джакобс (J.M. Jacobs and N.J. Jacobs: Arch. Biochem. Biophys. 1984, т. 229, с. 312 319). Образцы (по 0,2 мл) суспензии хлоропластов были подвергнуты предварительной инкубационной обработке в темноте в течение 15 мин при различных концентрациях ациофлуорфен-метила (АFM) или при концентрации ацетона 0,2% (об. доли) в случае контрольной пробы. Затем 50 мкл свежеприготовленного препарата Protogen с концентрацией около 15 нМ вводили в суспензию с целью инициирования реакции. Завершалась подготовка проб введением 2,75 мл фторометрического средства, которое предложили Джакобс и Джекобс (J.M. Jacobs and N.J. Jacobs: Enzyme), 1982, т. 28, с. 206 219), содержащего 1% (сб. доли) твин-20 (монолаурат полиоксиэтиленсорбитана), 50 мМ трис-НСl, и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты при рН 8,5, причем 1 мМ дитиоэритритола был замещен 5 мМ глутатиона. Затем взвеси анализировали методом прямого чтения на спектрофлуоротетре SPEX Fluorolog 2, оснащенном лицевым индикатором флуорасценции для замутненных биологических образцов. Количество образовавшегося Proto IX определяли по стандартной кривой графика зависимости между количественной эмиссией Proto IX при 630 нм и возбуждением при 400 нм, причем данная кривая были получена для чистого Proto IX во флуорометрической среде.

Для количественного определения степени неэнзиматического окисления до Proto IX в описанной выше пробе приготовили точно такую же пробу за исключением того, что вместо суспензии активных хлоропластов использовали суспензию, в которой хлоропласты были переведены в неактивное состояние нагреванием при 85oС в течение 15 мин. Вычитание количества Proto IX, полученного таким образом, из его количества, полученного в присутствии активных хлоропластов как раз и дает количество Proto IX, которое образовалось энзиматическим путем. Результаты представлены графически на чертеже, где LSD - наименьшее значащее различие (общепринятое обозначение). Чертеж показывает, что показатель I50 (концентрация, обеспечивающая 50%-ное ингибирование) составляет менее 0,1 мкМ, например, около 0,03 мкМ.

Испытание на влияние 10 мкМ AFM на энзиматическое превращение Proto IX в магнезиальный Proto IX в суспензии хлоропласта (в присутствии АТР) не показало никакого ингибирующего влияния AFM на это превращение.

П р и м е р 6. Согласно данному примеру ингибирующие энзимы активные компоненты были добавлены в пищу мышей, являющихся носителями опухолей, тогда как в пищу нескольких контрольных мышей никаких препаратов не добавляли. После этого мышей умерщвляли и извлекали их почки, кишечники, надпочечники, печень и опухоли, подвергнув их затем анализу на содержание Proto IX. Были использованы следующие ингибирующие энзимы активные соединения.

В частности опыты проводили на мышах линии DBA/2 На, которым в нулевой день в правое плечо вводили инъекцией подкожный опухолевый препарат SMT-F. Далее в первый день мыши получали специальную пищу для грызунов:

Purina Rodent Chow 5001 Mash без добавок. Далее на вторые десятые сутки мыши получали ту же пищу с добавкой испытуемого ингибирующего энзим активного соединения в количестве 2 промилле (контрольные животные получали такую же пищу, но без добавок). Добавку вводили в пищу путем перемешивания с небольшим количеством раствора испытуемого активного соединения в ацетоне. Далее мышей умерщвляли на десятые сутки за исключением мыши, обработанной активным соединением, обозначенным как 6j: эту мышь умерщвляли на седьмые сутки. Ткани животных оставляли на охлаждение на ночь при 4oС, а затем удаляли влаги промокательной бумагой и определяли массу каждого образца ткани. Далее из тканей готовили гомогенную суспензию в 5 мл (в случае тканей кишечника и печени 10 мл) смеси ацетона и 0,1 н NH4OH, взятых в объемном соотношении 9: 1. Затем гомогенный препараты были центрифугированы при 1500 г и всплывшие на поверхность вещества были подвергнуты анализу на спектрофлуорометре SPEX FA112. Для Proto IX оптимальными являются возбуждение при 400 нм и эмиссия при длине волны 630 нм. Накопление Proto IX определяли по числу флуоресцентных вспышек в секунду на 1 г ткани. Результаты представлены ниже в табл. 3 (для каждого препарата значения являются средними для пары мышей за исключением испытаний с использованием активных соединений 6f, 6h, 6i и 6j, когда для испытаний брали только одну мышь).



Указанные данные в табл. 4 числа соответствуют концентрациям Proto IX в соответствующих тканях. Единица измерения: ультраграммы (уг) Proto IX на 1 г ткани.

В цитированной выше статье Даферти (Doupherty) приведено значение 3,6 уг/г для концентрации порфирина в опухоли того же вида МТ-F после инъекции 10 мг/кг гематопорфирина мышам той же линии 1 ВА/2 На. В другой научной публикации авторов Моан и сотр. (Moan et al: P P 46 5, c. 713 721, см. прим. на рис. 2 на стр. 716) указано, что в случае опухолей типа СН/Tif (концентрацию порфирина порядка 12 уг/г, обеспечиваемую инъекцией в брюшную полость мышам линии DBA/Н2 фотофрина II (Photofrin II) в количестве 25 мг/кг, широко применяют для придания чувствительности к свету при фотодинамическом лечении и диагностировании раковых заболеваний.

Мыши поедали следующие суммарные количества пищи, содержащей активное соединение: 6а) 22 и 36 г; 6b) 37 и 35 г; 6с) 25 и 22 г; 6d) 41 и 32 г; 6е) 40 и 44 г; 6f) 27 г; 6g) 33 и 40 г; 6h) 36 г; 6i) 10 г; 6j) 20 г.

При проведении экспериментов, описанных в данном примере 6, на животных, не являющихся носителями опухолей, выполнялась нижеследующая последовательность операцией с использованием (если не оговорено иное) активного соединения, которое в данном примере имеет обозначение 6с.

а) В результате определения показателя LD50 активного соединения он оказался свыше 2600 мг/кг (то есть мг активного соединения на 1 кг массы тела) для крыс, когда этот показатель определяли через 14 дней после однократного поедания животным порции кукурузного масла, содержащего 15% активного соединения, и свыше 700 мг/кг для мышей, когда данный показатель определяли через 14 дней после однократного поедания животным порции того же масла, содержащего 5% активного соединения.

б) При испытаниях составов для инъекций в брюшную полость, не содержащих активного соединения, была установлена способность мышей переносить инъекции при дозе 0,5 мл смеси равных долей диметилсульфоксида и воды.

в) При испытаниях активного соединения, вводимого инъекцией в брюшную полость в составе смеси содержащей 60% кукурузного масла и 40% диметилсульфоксида, было установлено, что мыши способны переносить дозу 100 мг/кг.

г) На мышах были проведены следующие эксперименты:

1) Ежедневное скармливание дозы 50 мг/кг (с использованием 1%-ного раствора активного соединения в ацетоне) на протяжении 8 дней.

2) ежедневное введение инъекцией в брюшную полость дозы 50 мг/кг на протяжении 8 дней с использованием 1%-ной дисперсии активного соединения в минеральном масле, приготовленной растворением активного соединения в капле диметилсульфоксида и смешиванием полученного раствора с минеральным маслом;

3) ежедневное местное нанесение на кожу дозы 50 мг/кг на протяжении 8 дней с использованием 1%-ного раствора в диметилсульфоксиде,

4) кормление на протяжении 8 дней стандартной пищей с добавкой активного соединения в количестве 2 промилле от массы пищи;

5) ежедневные внутривенные инъекции дозы 50 мг/кг на протяжении 4 дней с использованием 2%-ного раствора в диметилсульфоксиде.

Затем мышей, взятых для экспериментов, умерщвляли, и определяли накопление Proto IX в их тканях.

В другом эксперименте самца крысы линии Fischer 344 на протяжении 24 дней кормили пищей, содержащей 5 промилле активного соединения 6с, после чего животное умерщвляли. В тканях этой крысы было замечено повышение уровней содержания Proto IX по сравнению с контрольным животным, причем заметное повышение этих уровней наблюдалось в тканях почки, кишечника, желудка и головка мозга, тогда как в тканях мышц отмечено лишь некоторое повышение уровня.

При проведении описанных выше экспериментов на крысах и мышах животных содержали при стандартном режиме совещания: 12 ч освещения и 12 ч темноты.

П р и м е р 7. При проведении серий экспериментов согласно примерам 1 и 2 культуры клеток НеL а инкубировали в присутствии перечисленных ниже различных лекарственных активных соединений с концентрацией 100 уМ. Приведенные после каждого обозначения лекарственного активного соединения показатели в показывают увеличение количества Proto IX, образующегося в присутствии данного лекарственного активного соединения, по отношению к тому количеству, которое образуется в контрольном образце в том же эксперименте.

Использованные активные соединения из примера 6 показали следующие значения: 6а) 337% 6b) 366% 6c) 297% 6d) 1200% 6e) 1210% 6f) 280% 6g) 326% 6h) 431% 6i) 544% 6j) 469% формулы других активных соединений и соответствующие процентные значения для них приведены ниже.



П р и м е р 8. В данном примере ингибирующее энзимы активное соединение 6с из примера 6 скармливали крысам с привитыми опухолями, после чего опухолевую зону облучали светом, вызывая тем самым рассасывание опухоли.

В частности трем крысам линии Sprague-Dawley массой в среднем по 120 г на период в 6 дней был назначен рацион питания с добавкой активного соединения в количестве 2 промилле. На третьи сутки на правую заднюю конечность каждой крысы имплантировали хондросаркому посредством инъекции 0,3 мл суспензии опухолевых клеток (1 миллион опухолевых клеток). На 6-е сутки правую заднюю конечность каждой крысы обривали для удаления волосяного покрова и измеряли размеры каждой опухоли. Далее область, пораженную опухолью, и окрестные участки кожи облучали нетепловыми дозами света с длиной волны 630 нм при плотности потока энергии 270 Дж/см2. На следующий день оказалось, что две крысы в заметной степени избавились от своих опухолей (то есть масса опухоли более не прощупывалась), а у третьей опухоль почти совершенно рассосалась. У всех крыс окружавшие опухоль участки кожной и мышечной тканей слегка побелели и казались как бы набухшими, но в значительно меньшей степени, нежели это имеет место в фотодинамической терапии с использованием препарата Photofrin II.

Приложение А.

Испытание на определение процентного показателя вымывания

В ходе испытания на определение процентного показателя вымывания применяли семядоли, собранные из проращенной в темноте огуречной рассады. На первой стадии массу семядолей обрабатывали в темноте водным раствором (в присутствии буферного соединения), содержащим сахар с радиоактивными мечеными атомами. Далее измеряли количество сахара, усвоенного семядолями, по описанной ниже методике расчета. Затем всю массу семядолей делили на две порции. Одну из этих порций обрабатывали в темноте водным раствором (в присутствии буферного соединения), содержащим испытуемое соединение, а другую точно так же обрабатывали в темноте тем же раствором, но без испытуемого соединения (контрольная проба). Замоченные в указанных водных растворах семядоли далее облучали светом в течение 16 ч после чего их отделяли от водных растворов, в которых методом измерения и расчета определяли содержание вещества с радиоактивными мечеными атомами. Полученные результаты были затем представлены в виде процентного показателя вымывания (ППВ), рассчитываемого по формуле:

ППВ (Sт Sc)/s

где S, Sт и Sc соответственно количества распадов (на одну семядолю) вещества с радиоактивными мечеными атомами: а) в этом веществе, усвоенном семядолями во время их первоначальной обработки, б) в водном растворе, содержащем испытуемое соединение, после облучения светом и в) в контрольном водном растворе после облучения светом.

Более подробно использованные материалы, а также условия проведения испытания на определение процентного показателя вымывания охарактеризованы ниже.

Растительный материал

В вермикулите, смоченном имеющимся в продаже удобрением 9-45-15, были проращены семена огурца Cocumis sativus L. сорт Wisconsin SMR 18, из которых в инкубационной камере при 25oС и относительной влажности воздуха 80 90% выращивали в темноте рассаду. Спустя 5 сут с момента высева из-под бледных, выращенных в темноте ростков рассады собирали семядоли и промывали их в 1,0 мМ растворе CaCl2. Все эти операции проводили при зеленом свете.

Буферный раствор

Раствор содержит 1 мМ КСl, 1 мМ СаСl2, 2,0 мМ фосфата калия и отрегулирован до рН 6,5 (как и при использовании NaOH).

Сахар с радиоактивными меченными атомами

Эта разновидность сахара представляет собой 3-0-метил-3-[u-14С]-глюкозу со специфической активностью 10,9 ГБк/мМ; поставщик: фирма "Амершэм Корп." (Amersham Corp.), г. Арлингтон хайтс, шт. Иллинойс, США.

Первоначальная обработка

180 230 штук промытых семядолей вводили в широкогорлую эрленмейеровскую колбу вместимостью 250 мл с пробкой из вспененного полиуретана, содержащую 50 мл буферного раствора, куда добавляли также сахар с радиоактивными мечеными атомами в количестве, обеспечивающем его концентрацию в растворе, равную 600 нМ. Колбу подвергали встряхиванию в темноте на вращающемся устройстве в течение 24 ч при 125 мин-1. Затем семядоли выгружали на сито из найлона и подвергали 3-кратной промывке порциями 1 мМ раствора СаСl2 по 20 мл каждая. Усвоение сахара с радиоактивными мечеными атомами определяли, растворяя 3 образца по 5 шт. семядолей каждый в растворителе тканей (марка NCS, производство фирмы "Амершэм Корп.") и подсчитывали итоговое истощение на спектрометре жидкостной сцинтилляции.

Было установлено, что эти эксперименты на истощение эквивалентны аналогичному определению, осуществляемому путем сжигания отобранных проб семядолей в самоокислителе.

Обработка с использованием испытуемого соединения, а также контрольная обработка.

Пять шт. семядолей оставляли плавать неосевой стороной вверх на поверхности буферного раствора, налитого в количестве 3 мл в пластмассовую чашку Петри диаметром 35 мм с крышкой. Затем туда вводили испытуемое соединение (в виде его раствора в ацетоне) в количестве, обеспечивающем заданную концентрацию (о которой сказано выше) испытуемого соединения в буферном растворе. Содержание ацетона в буферном растворе составляло 0,1% (об. доли) как в контрольной пробе, так и в растворе, содержащем испытуемое соединение. Далее плавающие семядоли в течение 16 ч совершали круговое движение в водовороте, образующемся в результате встряхивания чашек с частотой 90 мин-1 на поверхности вращающегося встряхивающего устройства.

Облучение светом

Чашки Петри с семядолями, плавающими на поверхности растворов, облучали в течение 16 ч светом четырех флуоресцентных ламп GE F20Т12-CW при заданной интенсивности 150 мкЕ/м2 в спектральной области фотосинтеза (СОФС), причем упомянутую интенсивность измеряли на поверхности семядолей, в то время как чашки подвергались непрерывному встряхиванию.

Измерение количества находящегося в жидкости вещества с радиоактивными мечеными атомами.

Всю жидкость отбирали от семядолей и затем определяли число распадов на спектрометре жидкостной сцинтилляции.

Т е м н о т а.

Все виды обработки до стадии облучения светом выполняли в темноте или при зеленом свете флуоресцентного источника, то есть при свете прошедшем сквозь зеленый отсекающий пластмассовый светофильтр, пропускающий свет с длинами волн 450 600 нм.

Приложение В.

Концентрат смеси, содержащей следы металла

Н3ВО3 100 mg/L

ZnSO47H2O 100 mg/L

MnSO44H2O 40 mg/L

COCl26H2O 20 mg/L

NaMoO42H2O 20 mg/L

CuSO4 4 mg/L

Среду А для культур готовили, добавляя к среде М 10%-ный водный раствор ацетата натрия с концентрацией 7,5 х 10-3 М в количестве 10 мл/л.

Все компоненты вводили в дистиллированную воду в порядке, указанном выше, после чего осуществляли их обработку в автоклаве под давлением 15 фунт/дюйм 2 в течение 15 мин.

Запас консервированного препарата для выращивания культур под действием света

Законсервированные культуры клеток у-1 аксенически переводили в жидкие культуры на среде А или М, предпочтительно на среде А, в эрленмейеровских колбах, закрытых полиуретановыми пробками, при 25oС в условиях цикла 14 ч освещения и 10 ч темноты. Консервированные культуры подвергали инкубированию (без дополнительного аэрирования) на вращающихся встряхивающих устройствах, работающих с частотой 125 мин-1. Интенсивность освещения на уровне слоя культуры составляла 120 мкЕ/м2.с (СРФС). В этих условиях культуры находятся в режиме полусинхронного роста до тех пор, пока они не перейдут в стационарную фазу содержащую (2 4) х 106 клеток в 1 мл.

Выращивание культур в отсутствие света (культуры, выращиваемые в темноте)

Клетки, находящиеся в стационарной фазе культивирования из законсервированной культуры, выращенные на свете в количестве 7,5 мл, переносили в эрленмейеровскую колбу, содержащую 750 мл среды А. Клетки подвергали инкубированию в темноте при аэрировании через заглубленную аэрационную трубку при температуре 25oС в течение 3 4 сут. За это время данная культура клеток у-1 должна была протерпеть 7 8 клеточных делений, утрачивая весь видимый хлорофилл, при концентрации клеток (2 3) х 106 шт/мл.

Приготовление клеток для использования в пробных испытаниях

Клетки отбирали из свежеприготовленной культуры в количестве 750 мл выращенной в темноте, посредством центрифугирования из малых оборотах (около 2000 мин-1) при 20oC в течение приблизительно 5 мин. Эти клетки осторожно переводили опять в состояние суспензии в 50 мл среды А. В пробе данной суспензии (около 0,25 мл) определяли подвижность клеток, а после закрепления 1% -ным водным раствором глутаральдегида подсчитывали число клеток в 1 мл. Обычно число клеток составляет 5 х 107 шт./мл. Порции культуры клеток по 1 мл содержащие по 107 шт. клеток, помещали в испытательные сосуды, например в фальконовские тарелки с 24-мя лунками, предназначенные для клеточных культур. На этой стадии клетки весьма подвижны и окрашены в желтый цвет.

Испытуемое соединение растворяли в подходящем растворителе, например, в ацетоне, этиловом спирте, диметилсульфоксиде или в воде (предпочтительно в ацетоне) для обеспечения концентрации, 1000-кратно превышающей конечную. В каждую пару лунок при помощи микрошприца вместимостью 5 или 10 мкл вводили по 1 мкл упомянутого испытуемого раствора. На каждой тарелке для клеточных культур готовили 4 контрольные лунки аналогично тому, как это описано выше, но при отсутствии испытуемого соединения. Тарелки для клеточных культур накрывали прозрачными пластмассовыми крышками и помещали на 13 16 ч в камеру выращивания при температуре 25oС и интенсивности освещения 70 90 мкЕ/кв.м.с. Если содержимое испытательных лунок желтело, то его извлекали так, как это описано ниже в п. "Оценка результатов". Если же содержимое испытательных лунок оказывалось прозрачным или бледно-зеленым, то его перед извлечением помещали на вращающееся встряхивающее устройство, работающее с частотой 125 мин-1, и в течение 2 ч облучали светом при интенсивности около 600 мкЕ/м2.с.

Оценка результатов

В каждую испытательную лунку вводили 250 мкл 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия и 1 мл метилового спирта, после чего содержимое лунки тщательно перемешивали. Полученные смеси выдерживали в темноте в течение 3 4 ч. Тарелки с клеточными культурами обрабатывали на центрифуге на малых оборотах (около 2000 мин-1) при комнатной температуре в течение 5 мин. Всплывающее на поверхность вещество снимали и анализировали на спектрофотометре "Бекман" (Beckman), 35-я модель в интервале длин волн 350 500 нм (на наличие протопорфирина IX, для которого в системе с упомянутым растворителем характерен как пик поглощения хлорофилла при 668 нм), а также при 720 нм, для того чтобы использовать фоновое показание мутности.

Анализ данных

Для каждой лунки вычитанием значения при 720 нм из значения при 668 нм получали показатель позеленения. Соответствующие величины являются средними для каждой концентрации испытуемого соединения, а также для контрольной пробы. Процентный показатель ингибирования находят по формуле: Q 100 x (1 k), где k отношение среднего значения показателя озеленения для данной конкретной концентрации к среднему значению показателя позеленения контрольной пробы. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ разрушения опухолевых клеток млекопитающих путем воздействия на них светом в присутствии порфирина, отличающийся тем, что перед обработкой светом клетки обрабатывают специфическим ингибитором энзиматического превращения протопорфириногена в протопорфирин IX под действием протопорфирин-оксидазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из ингибиторов используют или арилтриазолинон, или арилтетразолинон, или арилтриазиндион, или арилоксидиазол, или арилтетрагидроиндазол, или арилтетрагидрофталимид, или арилгидантоин, или арилуразол, или арилгексагидропиридазин, или арил гетероциклический уретан, или феноксифениловое соединение, или арилпиразол, или соединение формул





где Xb О или S;

Ph замещенный фенил.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ингибитором является растворимая в воде соль или кислое соединение, натриевая соль которого растворима в воде.

4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что ингибитор содержит арильную группу, заместитель которой является кислой группой сульфониламида или ее растворимой в воде солью.

5. Способ по пп. 1 4, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют соединение формулы



6. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку клеток проводят посредством орального введения ингибитора.

7. Фармацевтическая композиция для разрушения опухолевых клеток млекопитающих, содержащая биологически активное соединение и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве биологически активного соединения композиция содержит специфический ингибитор ферментативного превращения протопорфириногена в протопорфирин IX протопорфирин-оксидазой, имеющей показатель 150 для протопорфирин-оксидазы менее 1 мкм или обладающей отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом более чем 500 Мв.

8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что из ингибиторов используют или арилтриазолинон, или арилтетразолинон, или арилтриазиндион, или арилоксидиазол или арилтетрагидроиндазол, или арилтетрагидрофталимид, или арилгидантоин, или арилуразол, или арилгексагидропиридазин, или арил гетероциклический уретан, или феноксифениловое соединение, или арилпиразол, или соединение формул





где Хb O или S;

Ph замещенный фенил.

9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что ингибитором является растворимая в воде соль или кислое соединение, натриевая соль которого растворима в воде.

10. Композиция по пп. 7 9, отличающаяся тем, что ингибитор содержит арильную группу, заместитель которой является кислой группой сульфонамида или ее растворимой в воде солью.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что ингибитором является соединение формулы