СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕМ ОПУХОЛЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕМ ОПУХОЛЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

RU (11) 2079132 (13) C1

(51) 6 G01N33/48, G01N33/68 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.05.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.05.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 96101133/14 
(22) Дата подачи заявки: 1996.01.30 
(45) Опубликовано: 1997.05.10 
(56) Аналоги изобретения: Jribukait B. DNA Flow Cytometry in Carcinoma of the Prostate for Diagnosis and Study of Tumor Biologi. // Akta Oncologica. - 1991, v. 30, N 2, p.187-192. 
(71) Имя заявителя: Центральный научно-исследовательский рентгено- радиологический институт МЗМП РФ; Карелин Михаил Иванович 
(72) Имя изобретателя: Ягунов А.С.; Токалов С.В.; Карелин М.И. 
(73) Имя патентообладателя: Центральный научно-исследовательский рентгено- радиологический институт МЗМП РФ; Карелин Михаил Иванович 

(54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕМ ОПУХОЛЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 

Способ контроля за лечением опухолей предстательной железы. Использование: в области медицины, в частности в онкологии,и может применяться при диагностике и лечении онкологических заболеваний мочевыделительной системы. Сущность изобретения: производят забор биологического материала, в качестве которого используют утреннюю мочу больного и исследуют ее на содержание количества клеток с наличием ДНК больше,чем тетраплоидное, и/или более 5-7% количества клеток с наличием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, при этом мочу исследуют до и после пальцевого обследования предстательной железы. Контроль за последующим лечением осуществляют по изменению этих показателей, причем по уменьшению их значений судят о правильности выбранной тактики лечения. Способ позволяет исключить травматичность исследования и прост в использовании. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, точнее к онкологии,и может найти применение при диагностике и лечении онкологических заболеваний мочевыделительной системы.

Известен способ прогноза рака предстательной железы, включающий анализ распределения клеток из биологического материала по содержанию ДНК методом проточной цитометрии (1). При этом в качестве биологического материала используют операционный материал, полученный при простатэктомии.

В этом способе предварительно по клиническим показаниям производят простатэктомию, клетки выделяют из операционного материала, что требует длительного времени и окрашивают их ДНК-специфичным красителем, анализируют на стандартном проточном цитофлуориметре, определяя относительное количество клеток с аномальным содержанием ДНК, и по этой величине судят о стадии заболевания и прогнозируют скорость развития процесса и продолжительность жизни больного.

Метод хорошо зарекомендовал себя в медицинской практике. На большом клиническом материале (1152 случая), полученном на протяжении более 6 лет в разных странах 13 авторами (число обследованных больных и список авторов приведет в работе (1)), установлена корреляция относительного количества клеток из операционного материала с аномальным содержанием ДНК и стадией заболевания (p < 0,05).

В то же время использование операционного материала, полученного при простатэктомии, принципиально не позволяет проводить повторное обследование данным способом. Прогноз осуществляется на основании однократного анализа материала от первичного больного без учета результатов последующего лечения.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ контроля за лечением рака предстательной железы, включающий предварительное выявление заболевания путем определения содержания ДНК в опухолевых клетках из биологического материала с последующим проведением лучевой или химиотерапии, в котором в качестве биологического материала служит биопсийный материал.

В этом способе биопсийный материал получают с помощью трансректальной тонкоигольной биопсии, клетки выделяют их биопсийного материала обычными методами, аналогичными, что и в предыдущем способе, что требует длительного времени, затем клетки, окрашивают ДНК специфичным красителем, определяя относительное количество клеток с аномальным содержанием ДНК, а также долю клеток, синтезирующих ДНК, и по этим величинам осуществляют предварительное выявление рака предстательной железы, проводят контроль за эффективностью терапии и прогнозируют развитие заболевания.

В отличии от предыдущего предлагаемый способ является гораздо менее травматичным, поскольку для его осуществления достаточно использовать тонкоигольную биопсию, но в то же время остается длительным ввиду необходимости выделения клеток из биопсийного материала.

Использование этого способа принципиально позволяет провести повторное обследование больного, например, после проведения курса лучевой и /или/ химиотерапии.

Он позволяет также эффективно, как и предыдущий, прогнозировать развитие опухолевого процесса после постановки диагноза. При этом доля клеток с аномальным содержанием ДНК больше, чем тетраплоидной, практически линейно коррелирует со стадией заболевания.

Однако технические особенности проведения трансректальной пункционной биопсии, необходимой для получения биологического материала, приводят к тому, что примерно 10% раков при первой биопсии не выявляют из-за отсутствия раковых клеток в образце(3). При этом для снижения вероятности ложного результата делают 2-4 биопсии с объема опухоли.

Трансректальная тонкоигольная биопсия является достаточно травматичной процедурой, что осложняет многократное ее применение в процессе терапии для контроля за эффективностью лечения.

Технический результат предлагаемого изобретения состоит в ускорении выявления опухолевых клеток и снижении травматичности процедуры.

Этот результат достигается тем, что в известном способе контроля за лечением предстательной железы, включающем предварительное выявление заболевания путем определения содержания ДНК в опухолевых клетках биологического материала, согласно изобретению, в качестве биологического материала используют утреннюю мочу и после пальцевого обследования предстательной железы и при обнаружении в ней после пальцевого обследования увеличения клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное, и/или более 5-7% количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, судят о наличии в ней опухолевых клеток из предстательной железы, а контроль за последующим лечением осуществляют по изменению этих показателей, при этом по уменьшению их значений судят о правильности выбранной тактики лечения.

Использование в качестве биологического материала утренней мочи обеспечивает получение наиболее стабильных результатов по сравнению с анализами в дневное и вечернее время, причем использование ее для анализа позволяет выявить наличие опухолевых клеток, что свидетельствует о патологии мочевыделительной системы, анализ мочи после пальцевого обследования предстательной железы позволяет количественно оценить увеличение количества клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное, и/или количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования. Причем, как нами показано, сопоставлением результатов таких анализов с клиническими наблюдениями и гистологическими данными 124 больных с патологией мочевыделительной системы разной ликализации, увеличения в пробе после пальцевого обследования предстательной железы количества клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное, и/или более 5-7% количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, однозначно свидетельствует о наличии опухоли предстательной железы. К такому выводу мы пришли на основании многолетних исследований мочи у больных с патологией мочевыделительной системы.

На протяжении ряда лет проводилось обследование больных с патологией мочевыделительной системы. При этом исследовали распределение клеток по содержанию ДНК, полученных из осадка мочи больных, страдающих аденомами (23 случая) и раком (34 случая) предстательной железы, на проточной цитофлуориметре. Для оценки специфичности получаемых эффектов было также проведено обследование пациентов, страдающих заболеваниями почек (27 случаев), мочевого пузыря (18 случаев), а также больных, у которых по клиническим данным не было обнаружено патологии со стороны мочеполовой системы (12 случаев).

Результаты анализа распределения клеток из осадков мочи по содержанию ДНК показали, что цитокинематические параметры клеток выделенных групп пациентов имеют целый ряд отличительных признаков. При всех видах обследуемой патологии мочеполовой системы наблюдается увеличение числа ядросодержащих элементов в пробе по отношению к контролю. При этом если распределение в контроле характеризовалось отсутствием значимого количества клеток с содержанием ДНК больше диплоидного, то в остальных выделенных группах в распределении присутствовали клетки в S+G2+M фазах жизненного цикла. Кроме этого, при раке мочевого пузыря и при раке предстательной железы наблюдали полиплоидные клетки, т.е. клетки с содержанием ДНК больше тетраплоидного. В 4 из 12 случаев при раке мочевого пузыря наблюдали анэуплоидию в распределении клеток.

Сравнительный анализ параметров распределения клеток из осадков мочи больных, страдающих раком, аденомами предстательной железы и пациентов, у которых отсутствовала патология со стороны мочеполовой системы (контроль), выявил прежде всего достаточно резкие различия в количестве клеток. Их число у больных, страдающих раком предстательной железы, более чем в десять раз превышало аналогичный показатель у больных аденомами (p < 0,01). У последних же величина этого показателя была достоверно выше, чем в контроле (p < 0,01). В то же время вариабельность этого показателя оказалась весьма велика, что в ряде случаев приводило к перекрыванию его значений у больных из разных групп и существенно снижало его диагностическую ценность. Анализ гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК оказался более информативным. Сравнительный анализ процентного содержания клеток, находящихся в G0+G1 фазах цикла и элементов с плоидностью менее 20, показывает, что по этим показателям группы больных, страдающих аденомами и раком предстательной железы, мало отличаются друг от друга, хотя и отличаются от контроля (p < 0,05).

Отсутствие разницы можно объяснить маскирующим действием других клеток, прежде всего лейкоцитов, всегда присутствующих в мочевом осадке и имеющих диплоидный набор хромосом. Клетки, содержащие количество ДНК менее диплоидного ( < 2C) это в основном поврежденные элементы или их фрагменты, образовавшиеся в процессе выделения и окраски образца. Поэтому вариабельность этого показателя существенно зависит от времени хранения образца до фиксации материала. При анализе распределения клеток у больных с аденомами предстательной железы выделить отдельно клетки, находящиеся в S или G+M фазах не представлялось возможным, поскольку процентное содержание последних в большинстве случаев было столь невелико, что пик в районе 40 практически не выявлялся. При аденоме предстательной железы подавляющее большинство из них составляют клетки в фазе синтеза ДНК (S фаза). В то же время при раке предстательной железы отчетливо формировался второй пик распределения, соответствующий клеткам в G2+M фазах (4C), что позволяло легко выделить ДНК-синтезирующие клетки. В результате процентное содержание клеток в S+M фазах при раке предстательной железы оказалось значительно (p < 0,001) выше, чем при аденоме. При этом отмечались также клетки с плоидностью более 4C (7,5+2,0%). Значительное увеличение процентного содержания клеток в G2+M фазе при регистрации полиплоидных элементов могло быть обусловлено как усилением пролиферации и/или изменением длительностей отдельных фаз жизненного цикла, так и появлением клона тетраплоидных клеток. Однако последнее осталось лишь предложением, поскольку ни в одном случае клона полиплоидных клеток в районе 8C обнаружено не было. В то же время во всех исследованных образцах мочи при аденомах предстательной железы как анэуплоидные, так и полиплоидные клеточные клоны полностью отсутствовали. В свою очередь при аденоме предстательной железы было выявлено 6,0+0,9% клеток в S+G2+M фазах, которые отсутствовали в контрольных образцах.

Таким образом, на основании анализа распределения клеток из осадков мочи были дифференцированы больные, страдающие раком, аденомами предстательной железы, и пациенты, у которых патологии со стороны мочевыделительной системы обнаружено не было.

Аналогичные результаты были получены при сравнительном анализе распределения клеток у больных, страдающих папилломатозом, раком мочевого пузыря и в контроле. Количество клеток в мерной пробе при раке мочевого пузыря оказалось выше, чем при папилломатозе (p < 0,05). Во всех случаях при раке мочевого пузыря отмечали наличие полиплоидных элементов, которые отсутствовали при папилломатозе. Процентное содержание клеток в S+G2+M фазах у 8 больных, страдающих раком мочевого пузыря (у которых в распределении клеток отсутствовала анэуплодия), также оказалось выше, чем при папилломатозе (p < 0,05). В свою очередь при папилломатозе мочевого пузыря было обнаружено 4,2+0,9% клеток в S+G2+M фазах, которые отсутствовали в контроле. Кроме этого, у 4 из 12 больных, страдающих раком мочевого пузыря, наблюдали наличие анэуплоидии в распределении клеток по содержанию ДНК, причем в этих случаях присутствовали как анэуплоидные, так и полиплоидные клетки.

У больных, страдающих различными заболеваниями почек, распределение клеток по содержанию ДНК было подобно тому, которое наблюдали у больных с доброкачественными процессами в мочевом пузыре и предстательной железе.

Результаты проведенных нами исследований показали, что распределение ядросодержащих элементов по содержанию ДНК в осадках мочи различно у больных, страдающих аденомами и раком предстательной железы, и папилломами и раком мочевого пузыря соответственно.

Полученные данные по дифференциально диагностике рака предстательной железы подтверждаются результатами цитологических исследований материала, полученного при трансректальной тонкоигольной биопсии с целью уточнения клинического диагноза (28 случаев).

Таким образом, анализ числа и распределения ядросодержащих элементов из осадков мочи по содержанию ДНК методом проточной цитофлуориметрии позволяет дифференцировать больных, страдающих аденомами и раком предстательной железы. Указанный способ может быть использован в клинической практике для предварительного скрининга этих пациентов. Полная физиологичность получения материала позволяет осуществлять постоянный мониторинг опухолевой прогрессии в процессе лечения.

Однако, как показывают приведенные выше данные, наличие аномальных клеток в осадке мочи первичного больного могут быть свидетельствовать патологического процесса не только в предстательной железе, но и в почках, мочевом пузыре и т.д. Следовательно, по анализу мочи сделать однозначный вывод о локализации заболевания не представляется возможным. Это побудило нас к поиску особенностей обследования больных с патологией предстательной железы. Каждый первичный больной, страдающий заболеванием предстательной железы, подвергается пальцевому обследованию. Мы сделали попытку проанализировать клетки из осадка мочи больного, как уже выше сказано, до и после пальцевого обследования. Были обследованы четыре группы пациентов, в одной из которых по гистологическим данным был подтвержден рак предстательной железы, во второй аденома предстательной железы, в третьей рак мочевого пузыря и в четвертой - пациенты, у которых в патологии со стороны мочевыделительной системы обнаружено не было (всего 28 человек).

При этом увеличение количества клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное, и/или более 5 7% количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, наблюдали только в группе больных, страдающих раком предстательной железы. Увеличение 2-3% количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, наблюдали и в группе больных, страдающих аденомами предстательной железы. Однако в последнем случае прирост их количества был в основном обусловлен ДНК-синтезирующими клетками (S фаза) при полном отсутствии клеток с содержанием ДНК большим, чем тетраплоидное. Это позволяло легко дифференцировать пациентов указанных групп.

Таким образом, анализ распределения клеток из осадков мочи у больных до и после пальцевого обследования позволяет отдифференцировать заболевания предстательной железы от патологии других органов мочевыделительной системы. Причем проведение такого анализа не требует длительной процедуры выделения клеток, как это необходимо при использовании биопсийного материала, что значительно сокращает время осуществления анализа. Метод полностью атравматичен, что позволяет проводить его многократно до, во время и после лечения, т.е. осуществлять постоянный контроль за эффективностью проводимого лечения.

Сущность способа заключается в следующем.

Утреннюю мочу в количестве 30 50 мл получают от больного непосредственно перед обследованием. Затем проводят пальцевое обследование предстательной железы и через 20 30 мин после его окончания получают вторую порцию мочи примерно такого же объема. Клетки в мерной пробе осаждают центрифугированием при комнатной температуре в стандартных условиях центрифугирования для животных клеток. Затем надосадочную жидкость сливают, а клетки из осадка мочи ресуспендируют в мерной пробе фиксирующе-окрашивающей смеси, содержащей 25% -ный этанол на физиологическом растворе и ДНК-специфичный краситель Hoechst-33258 (Sigma) в концентрации 2 мг/мл. Через 15 30 мин анализируют окрашенную взвесь на проточном цитофлуориметре, определяя общее количество ДНК-содержащих частиц, долю клеток с содержанием ДНК большим, чем у нормальных диплоидных,и процентное содержание аномальных клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное. При обнаружении во второй пробе увеличения количества клеток с содержанием ДНК больше,чем тетраплоидное, и/или более 5 - 7% количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с первой пробой, судят о наличии в ней опухолевых клеток из предстательной железы. Оценку эффективности лечения проводят по динамике содержания в моче опухолевых клеток и по снижению их количества судят о его эффективности проводимого терапевтического воздействия.

Сущность способа поясняется данными таблицы.

Больной: Аношкин Николай Иванович, 1926 года рождения, История болезни 1858.

Диагноз при поступлении фиброаденома предстательной железы.

При обследовании в клинике ЦНИРРИ больной подвергался стандартным диагностическим процедурам, а также обследованию предлагаемым способом для уточнения диагноза. 23.03.93 был проведен анализ распределения клеток из осадка мочи по содержанию ДНК. При этом было установлено наличие анэуплоидных клеток После этого 25.03.93 было проведено пальцевое обследование с последующим взятием мочи, а затем биопсийного материала с помощью трансректальной тонкоигольной биопсии предстательной железы. При анализе мочи предлагаемым методом было установлено значительное увеличение процентного содержания анэуплоидных клеток с содержанием ДНК более 4C. На основании этого был поставлен предварительный диагноз рак предстательной железы. Через день диагноз был верифицирован стандартными цитологическими методами на основании анализа биопсийного материала.

При подготовке к операции больной продолжал многократно обследоваться с помощью предлагаемого метода для подтверждения диагноза и оценки опухолевой прогрессии.

Больному была проведена орхэктомия с последующей химиотерапией. В промежутках между операций и химиотерапией и после химиотерапии было проведено две серии обследования больного для оценки эффективности проводимой химиотерапии. Результаты анализа показали снижения числа анэуплоидных клеток в пробах, что свидетельствует об эффективности проводимого лечения. Общеклинический статус больного также свидетельствовал об улучшении его состояния. Больной был выписан для амбулаторного наблюдения и находится в состоянии ремиссии до настоящего времени.

Таким образом проведена диагностика и контроль за последующим лечением с коррекцией проводимой терапии 6 больных, страдающих раком предстательной железы.

По сравнению с известными данный способ имеет ряд преимуществ:

полностью атравматичен;

позволяет получить окончательный результат в течение 30 мин после получения материала;

позволяет проводить дифференциальную диагностику аденомы и рака предстательной железы;

физиологичность получения материала для анализа позволяет проводить многократные обследования пациентов, практически неосуществимые при анализе биопсийного и тем более операционного материала и осуществлять действенный контроль за эффективностью лечения;

прост в исполнении и может быть использован не только в клинических, но и поликлинических условиях, в том числе для предварительного скрининга больных. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ контроля за лечением опухолей предстательной железы, включающий предварительное выявление заболевания путем определения содержания ДНК в опухолевых клетках биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют утреннюю мочу до и после пальцевого обследования предстательной железы и при обнаружении в ней после пальцевого обследования увеличения количества клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное и/или более 5 7 количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, судят о наличии в ней опухолевых клеток из предстательной железы, а контроль за последующим лечением осуществляют по изменению этих показателей, при этом по уменьшению их значений судят о правильности выбранной тактики лечения.