ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2272290

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ЛЕГКИХ

Имя заявителя:  
Имя изобретателя:  Евгущенко Галина Владимировна (RU); Коваленко Мария Александровна (RU); Ловачева Ольга Викторовна (RU); Можаева Татьяна Евгеньевна (RU); Стацук Татьяна Анатольевна (RU); Сычева Людмила Петровна (RU); Шереметьева Светлана Михайловна (RU) 
Имя патентообладателя: Государственное учреждение Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН (RU)
Адрес для переписки: 107564, Москва, ул. Яузская аллея, 2, ГУ Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, О.В. Ловачевой 
Дата начала действия патента:  2004.04.28 

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии и онкологии. Способ позволяет повысить достоверность дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких. Проводят исследование клеток бронхиального эпителия, полученных во время бронхобиопсии больного путем браш-биопсии, при этом в указанных клетках бронхиального эпителия производят количественный подсчет ядерных протрузий, для выявления которых клетки просушивают, фиксируют в свежеприготовленной смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, высушивают на воздухе, окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина, промывают нагретой дистиллированной водой, высушивают на воздухе, докрашивают цитоплазму клеток 1% спиртовым раствором светлого зеленого, промывают дистиллированной водой, после чего клетки анализируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете и подсчитывают по 1000 эпителиальных клеток, среди которых определяют долю клеток с протрузиями в промилле, и при содержании клеток бронхиального эпителия с наличием ядерных протрузий до 30% устанавливают заболевание больного туберкулезом, а свыше 30% - отмечают злокачественные поражения легких.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных опухолей легких.

Известно, что после воздействия на организм человека ионизирующей радиации, облучения злокачественных опухолей, а также химиотерапии у пациентов наблюдаются различные формы морфологических аномалий клеток. Одним из распространенных видов ядерных аномалий являются ядерные протрузии, представляющие собой нитевидные и/или шаровидные ядерные структуры за пределами основного ядра, соединяющиеся с ним перемычками. Ядерные протрузии наблюдаются с очень низкой частотой практически во всех тканях и с высокой частотой - в злокачественных опухолях разного типа.

Известен способ определения частоты ядерных протрузии в клетках облученных пациентов (см. В.Ю.Кравцов, Ю.А.Логинова, Р.Ф.Федорцева, Е.В.Старкова "Ядерные протрузии в лимфоцитах периферической крови облученных пациентов" // Новости клинической цитологии России, том 3, №3-4, 1999, стр.103-107). Ядерные протрузии были исследованы в группе, которую составили пациенты, подвергшиеся воздействию ионизирующей радиации. Сущность данного способа заключается в том, что у пациентов обычным способом берут из пальца каплю крови, получают из нее мазки. Полученные мазки крови высушивают, фиксируют 96% этиловым спиртом, а затем окрашивают азур 2-эозином по Романовскому. 

Недостатками известного способа являются:

- непригодность его использования для определения частоты ядерных протрузий в эпителиальных клетках и других клетках с плотным контактом. При получении суспензии таких клеток небольшая часть из них разрушается и образовавшийся детрит при окраске по Романовскому маскирует протрузии и другие ядерные аномалии;

- окрашивание на препарате микробных клеток, которые также могут мешать корректному выявлению протрузий.

Известен способ диагностики туберкулеза легких (В.П.Филиппов "Бронхологические исследования в дифференциальной диагностике туберкулеза", Москва, изд. "Медицина", 1979, с.230), выбранный в качестве прототипа и заключающийся в том, что в материале браш-биопсии при цитологическом исследовании находят клетки, характерные для туберкулеза легких: эпителиоидно-клеточную гранулему, клетки Пирогова-Ланхганса, соли кальция, казеоз, реже микобактерии туберкулеза.

Для успешной дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных опухолей легких материал браш-биопсии обязательно должен содержать патогномоничные клетки: элементы туберкулезного воспаления и/или микобактерии туберкулеза при туберкулезе легких; клетки злокачественной опухоли при онкологической патологии. Если же этих клеток нет, а есть только бронхиальный эпителий и клетки неспецифического воспаления, то диагноз поставлен быть не может. Однако при биопсии не всегда можно попасть в свежий очаг туберкулезного воспаления или процесс находится в стадии затихания, или ограничен капсулой, как при туберкулеме.

Таким образом, эффективность диагностики по этому способу в значительной степени зависит от точности попадания в очаг поражения и от состояния бронха, дренирующего очаг поражения. Наиболее эффективны такие биопсии под контролем аппаратов лучевой диагностики (рентгеновских или УЗИ). Это приводит к тому, что известный способ наиболее эффективно применяется в специализированных центрах, хотя выполнение самой браш-биопсии доступно для любого специалиста по эндоскопии. 

Кроме того, при злокачественных поражениях легких раковые клетки в материале браш-биопсии встречаются в 50-70%, а в остальных случаях такие клетки у больных не находят, и, следовательно, провести диагностику злокачественных опухолей легких в данном случае невозможно.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение достоверности дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики туберкулеза злокачественных поражений легких путем исследования клеток бронхиального эпителия, полученных во время бронхоскопии больного путем браш-биопсии, согласно изобретению в указанных клетках бронхиального эпителия производят количественный подсчет ядерных протрузий. Для выявления протрузий клетки просушивают, фиксируют в свежеприготовленной смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, высушивают на воздухе, окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина, промывают нагретой дистиллированной водой, высушивают на воздухе, докрашивают цитоплазму клеток 1% спиртовым раствором светлого зеленого, промывают дистиллированной водой, после чего клетки анализируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете и подсчитывают по 1000 эпителиальных клеток, среди которых определяют долю клеток с протрузиями в промилле, и при содержании клеток бронхиального эпителия с наличием ядерных протрузий до 30 устанавливают заболевание больного туберкулезом, а свыше 30 - отмечают злокачественные поражения легких.

Целесообразно просушенные клетки фиксировать в этиловом спирте и ледяной уксусной кислоте, взятых в соотношении 3:1, в течение 10 минут, окрашивать предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина при 37°С в течение часа, промывать препарат после окраски в 2-х сменах дистиллированной воды, нагретой до 37°С, докрашивать цитоплазму клеток в течение 1-2 минут.

Предлагаемый способ подготовки материала к микроскопическому исследованию позволяет корректно выявлять ядерные протрузии, т.е. отличать их от микробов, цитоплазматических включений или детрита, путем применения специфичного для ядерного хроматина красителя - ацетоорсеина. Докраска цитоплазмы светлым зеленым позволяет достигать еще большего контраста для выявления ядерного материала, в том числе протрузий, и четко определять границы клеток, что важно для подсчета частоты клеток с протрузиями.

Предлагаемый способ позволяет проводить дифференциальную диагностику туберкулеза и злокачественного опухолевого процесса в легких, используя материал браш-биопсии в случае, когда он не содержит патогномоничных клеток, для диагностики онкологической патологии или туберкулеза, путем определения частоты протрузий ядра клеток бронхиального эпителия. Клетки бронхиального эпителия в материале браш-биопсии присутствуют в достаточном количестве всегда, при этом необязательно точно попадать в очаг поражения, достаточно использовать браш-биопсию из бронхов пораженного сегмента, а протрузии ядра может видеть в обычный микроскоп любой врач-цитолог. При определении высокой частоты клеток с протрузиями в бронхиальном эпителии существует большая доля вероятности, что этот процесс - онкологический.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики злокачественного опухолевого и туберкулезного процессов в легком применим у тех больных, у которых не удалось получить этиологически значимые клетки в материале биопсии (при опухоли - злокачественные клетки, при туберкулезе - клетки туберкулезного воспаления и/или микобактерии туберкулеза). Для осуществления способа не надо особо точного попадания инструментом в очаг поражения в легком, достаточно получить при бронхоскопии бронхиальный эпителий из сегментарного бронха.

Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких, согласно изобретению, осуществляют следующим образом.

Клетки бронхиального эпителия, полученные во время бронхоскопии путем браш-биопсии, наносят на предметное стекло. Препарат хорошо просушивают, фиксируют в свежеприготовленном фиксаторе: смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 10 минут. Высушивают на воздухе в течение 1-2 минут. Окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина при 37°С в течение часа. Промывают в 2-х сменах прогретой до 37°С дистиллированной воды. Высушивают на воздухе. Докрашивают цитоплазму клеток 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 1-2 минут. Промывают в двух сменах дистиллированной воды. Окрашенные препараты можно хранить длительное время (несколько лет).

Препараты анализируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете. Подсчитывают по 1000 эпителиальных клеток и среди них определяют долю клеток с протрузиями в промилле. При содержании клеток бронхиального эпителия с наличием ядерных протрузий до 30 устанавливают заболевание больного туберкулезом, а свыше 30 - отмечают злокачественные поражения легких.

Предлагаемым способом ядерные протрузий в клетках бронхиального эпителия были исследованы у 24 больных: у 15 больных туберкулезом (5 женщин и 10 мужчин) и 9 больных с различными злокачественными опухолями (6 женщин и 3 мужчин). Возраст обследуемых - от 13 до 73 лет. 

Диагноз туберкулеза в последующем у всех больных был подтвержден с помощью бактериологических методов или морфологически при исследовании резецированного участка легкого.

Диагноз злокачественной опухоли у 9 больных впоследствии подтвержден морфологически при исследовании резецированного участка легкого.

Материал для исследования получен во время бронхоскопии методом браш-биопсии. Исследовали препараты, окрашенные ацетоорсеином. Подсчет ядерных протрузий производили на 1000 клеток от каждого больного.

При изучении клеток бронхиального эпителия у больных с впервые выявленным туберкулезом ядерные протрузии встречались от 2 до 26 (в среднем 15,27±2,78), у больных со злокачественными новообразованиями отмечалось от 30 до 124 ядерных протрузий (52,46±6,64). Причем, повышение частоты ядерных протрузий выявлено на препаратах, не содержащих опухолевых клеток. Это позволило предположить наличие злокачественной опухоли у больных, что позднее было подтверждено морфологически. Отличия по частоте ядерных протрузий у больных туберкулезом и злокачественными новообразованиями высокодостоверны (критерий Манна-Уитни менее 0,001).

Полученные результаты, основанные на количественном подсчете ядерных протрузий, свидетельствуют о возможности использования данного метода как дополнительного для дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественной опухоли легких в случаях когда малоинвазивные биопсии (не требующие хирургического вмешательства) оказались неинформативными, а также как один из критериев высокого риска наличия злокачественной опухоли - при обосновании показаний для хирургического вмешательства.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких путем исследования клеток бронхиального эпителия, полученных во время бронхобиопсии больного путем браш-биопсии, отличающийся тем, что в указанных клетках бронхиального эпителия производят количественный подсчет ядерных протрузий, для выявления которых клетки просушивают, фиксируют в свежеприготовленной смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, высушивают на воздухе, окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина, промывают нагретой дистиллированной водой, высушивают на воздухе, докрашивают цитоплазму клеток 1%-ным спиртовым раствором светлого зеленого, промывают дистиллированной водой, после чего клетки анализируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете и подсчитывают по 1000 эпителиальных клеток, среди которых определяют долю клеток с протрузиями в промилле, и при содержании клеток бронхиального эпителия с наличием ядерных протрузий до 30% устанавливают заболевание больного туберкулезом, а свыше 30% - отмечают злокачественные поражения легких.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что просушенные клетки фиксируют в этиловом спирте и ледяной уксусной кислоте, взятых в соотношении 3:1, в течение 10 мин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что после фиксации клетки окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5%-ным раствором ацетоорсеина при 37°С в течение часа.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что после окраски клетки промывают в 2-х сменах дистиллированной воды, нагретой до 37°С.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что докрашивают цитоплазму клеток 1%-ным спиртовым раствором светлого зеленого в течение 1-2 мин.

Версия для печати
Дата публикации 25.05.2007гг


вверх