ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2268475

СПОСОБ ВЕРИФИКАЦИИ РАННИХ ДИАГНОЗОВ ФИБРОЗНО-КИСТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ И РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Имя заявителя:  
Имя изобретателя:  Крылов Анатолий Иванович (RU); Силенко Светлана Георгиевна (RU); Болтовская Марина Николаевна (RU); Радзинский Виктор Евсеевич (RU) 
Имя патентообладателя: Крылов Анатолий Иванович (RU)
Адрес для переписки: 107207, Москва, ул. Алтайская, 4, кв.297, А.И. Крылову 
Дата начала действия патента:  2004.06.16

Изобретение относится к медицине, в частности к маммологии и онкологии. Для осуществления способа, дополнительно к цитологическому исследованию, содержимое кист молочной железы исследуют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на наличие эндометриального белка альфа-2-микроглобулина фертильности (АМГФ). Выявление АМГФ в содержимом кисты позволяет с вероятностью 80% подтвердить цитологический диагноз внутрикистозного рака молочной железы. Отсутствие АМГФ в содержимом кист молочных желез позволяет подтвердить цитологический диагноз фиброзно-кистозной болезни с вероятностью 99%. Способ обеспечивает повышение точности и информативности ранней (дооперационной) диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований молочной железы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к оценке состояния органов репродуктивной системы женщин, и предназначено для повышения точности дооперационной (ранней) диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований молочной железы.

ПРЕДШЕДСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время рак молочной железы (РМЖ) занимает третье место среди причин смертности женского населения (с учетом всех возрастных групп) после болезней системы кровообращения и несчастных случаев, при этом в структуре смертности от онкологических заболеваний с 1996 года по настоящий момент он занимает лидирующее первое место, оказывая максимальное влияние на сокращение средней продолжительности жизни женщин [Аксель Е.М., Давыдов М.И. Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований: Россия, 2000. Сборник «Злокачественные новообразования в России и странах СНГ», Москва, 2002, с.85-106; Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Злокачественные новообразования в России (статистический сборник), Москва, 1999].

В современных научных исследованиях и программах улучшения репродуктивного здоровья населения все большее внимание уделяется исследованию роли локально продуцируемых факторов с аутокринно/паракринным механизмом действия в генезе доброкачественных и злокачественных образований женской половой сферы, которые, как показывают современные исследования, могут являться модуляторами гормональных влияний на клеточном и тканевом уровнях [Сметник В.П. Половые гормоны и молочная железа (обзор литературы). Гинекология, Москва, 2000, Том 2, №5, с.133-136]. В частности, все большее внимание уделяется эндометриальному белку альфа2-микроглобулину фертильности (синонимы: АМГФ, glycodelin), приоритет открытия которого (1976), принадлежит отечественному исследователю Петрунину Д.Д. [Петрунин Д.Д. Специфические белки плаценты человека. Дисс. на соискание ученой степени д.м.н., Москва, 1989, с.204].

Известно, что названный белок представлен в научной и патентной литературе в качестве основного секреторного иммуноглобулина женской репродуктивной системы, роль которого непосредственно связана с реализацией репродуктивной функции человека [Петрунин Д.Д. Специфические белки плаценты человека. Дисс. на соискание ученой степени д.м.н., Москва, 1989, с.204; Болтовская М.Н. Роль эндрометриальных белков и клеток-продуцентов в репродукции человека. - Дисс. на соискание ученой степени д.б.н., 2001, с.265].

С учетом этого актуальным является не только разработка новых методов ранней диагностики РМЖ, но и фоновых предраковых процессов на молекулярном, биохимическом и генетическом уровнях.

Поиск и изучение для этих целей новых опухолеассоциированных маркеров предоставляет дополнительные возможности для повышения эффективности оценки характера новообразования [Артамонова Е.В., Тупицын Н.И., Кадагидзе З.Г. с соавт. Роль эпителиальных антигенов в диагностике и стадировании рака молочной железы. Архив патологии, Москва, 2002, №6, с.13-15].

В патентных источниках информации известен ряд методов диагностики и прогнозирования некоторых заболеваний в онкологии, маммологии и гинекологии, основанных на определении плацентарных и некоторых других белков (патенты РФ №№2049999, 2172490, 2177154, 2164687, 2205597, 2052202, 2107916). 

В то же время известны также некоторые сведения о возможности продукции эндометриального белка АМГФ тканью молочной железы, упоминаемые в некоторых зарубежных источниках [Kamarainen M., Halttunen M., Koistinen R., von Boguslawsky К., von Smitten К., Andersson L.C., Seppaja M. Expression of glycodelin in human breast and breast cancer. Int. J. Cancer, 1999, Dec. 10; 83(6):738-42]. 

Единственным отечественным источником наиболее полной информации о секреции данного белка молочной железой являются данные, представленные в работе Силенко С.Г. [Силенко С.Г. Гинекологическое здоровье женщин с доброкачественными заболеваниями молочных желез в пременопаузе. Дисс. на соискание ученой степени к.м.н., Москва, 2004, с.167].

Однако в научной и патентной литературе не выявлены сведения, содержащие решения диагностических задач по оценке патологии молочной железы на основе выявления в ней указанного белка.

Известен способ диагностики и лечения кист молочной железы, основанный на применении лучевых и не лучевых исследований инвазивного и не инвазивного характера, выполняемых в несколько этапов, с преобладанием инвазивных методик без искусственного контрастирования над инвазивными методиками с искусственным контрастированием. Весь диагностический цикл составляет комплексное клиническое обследование, включающее сбор анамнеза, обзорную маммографию, дополняемую ультразвуковым исследованием (УЗИ) молочных желез, затем, по показаниям, выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии под ультразвуковым контролем, проведение пункционной биопсии под рентгенологическим контролем. По отдельным показаниям выполняются мероприятия с искусственным контрастированием, в том числе пневмокистография и дуктография [Харченко В.П., Рожкова Н.И., Прокопенко С.П. Применение инвазивной рентгенорадиологии в диагностике и лечении кист молочной железы. Актуальные проблемы маммологии, Москва, 2000, с.100-114].

Достоинства приведенного способа диагностики и лечения заболеваний молочных желез в том, что он позволяет дифференцированно диагностировать кисты молочных желез с точностью 100%, проводить консервативное лечение кист молочной железы с использованием специальных склерозантов, снижающих долю оперативного лечения кист до 80%, а также позволяет уменьшить ошибки при выборе способов хирургического и консервативного лечения. 

Недостатками данного способа являются: необходимость технического оснащения стационаров дорогостоящим оборудованием, в том числе маммографическими установками, УЗ-аппаратами, компьютерами, фототехникой, вспомогательными устройствами и приспособлениями; высокие требования к подготовленности и квалификации врачей и технического персонала, его значительная численность; длительность и высокая стоимость диагностических процедур, а главное, трудность дифференциальной диагностики доброкачественных и ранних форм злокачественных новообразований. 

Наиболее близким по технической сущности, решаемым задачам и достигаемому результату является известный метод диагностики неопухолевых и опухолевых образований молочной железы, обеспечивающий на основе цитологических методов выявление и дифференциацию различных заболеваний молочной железы, верификацию клинико-инструментального исследования, выявление предраковых состояний эпителия, обнаружение рака при малосимптомном течении со скудной клинической, маммографической, ультразвуковой симптоматикой в начальной стадии заболевания, определение степени дифференцировки клеток рака и его гистологической формы [Невская Е.А, Легков А.А., Бурдина Л.М., Пинхосевич Е.Г. Клиническое значение цитологического метода при обследовании женщин с заболеваниями молочной железы. Актуальные проблемы маммологии, Москва, 2000, с.44-49].

К достоинствам данного способа относятся возможности исследования различных цитологических объектов (жидкостей из кистозных образований, выделений и пунктатов из опухолевидных образований, уплотнений и инфильтратов, в том числе в послеоперационной зоне); возможности формулирования цитологических заключений на основе международной гистологической классификации опухолей молочной железы.

К недостаткам данного способа относятся: цитологическое заключение не является самостоятельным для клинициста, так как требует учета клинических проявлений и результатов других диагностических методов (маммографии, УЗИ, пневмокистографии и др.); необходимость повторных цитологических исследований в случае расхождения цитологических заключений с результатами других методов и клиническими данными; необходимость гистологических исследований в случаях, когда цитологическое заключение о злокачественном характере новообразования не подтверждается клиническими данными и результатами других диагностических исследований, при этом достаточная информативность метода может быть обеспечена лишь при условии высокой квалификации персонала.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения являются: повышение точности и информативности ранней (дооперационной) диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований молочной железы, сокращение времени и материальных затрат на этапе ранней диагностики, снижение уровня оперативных и инвазивных вмешательств на молочной железе, расширение арсенала диагностических средств и области применения эндометриальных белков (АМГФ) для диагностических и прогностических целей.

Сущность заявленного способа состоит в том, что с целью повышения точности и информативности ранней (дооперационной) диагностики ФКБ и РМЖ наряду с традиционным цитологическим и другими методами проводят исследование содержимого кист на наличие в нем эндометриального белка АМГФ при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), по результатам которого подтверждают диагнозы ФКБ и/или внутрикистозного РМЖ. В частности, при выявлении АМГФ подтверждают диагноз внутрикистозного РМЖ, а при его отсутствии подтверждают доброкачественность новообразования (ФКБ).

Способ осуществляется следующим образом. При комплексной диагностике заболеваний молочных желез определяют образования (кисты), требующие углубленного цитологического исследования, при этом проводят стандартную тонкоигольную (диаметр 1 мм) аспирацию содержимого кисты. Для цитологического исследования полученную внутрикистозную жидкость центрифугируют по стандартной методике (5000 оборотов в мин., 10 минут). Образовавшийся осадок используют для цитологического исследования, при этом надосадок (супернатант) используют для определения в нем эндометриального белка АМГФ.

Определение АМГФ способом ИФА в супернатанте проводят иммуноферментным сендвич-методом с помощью оригинальных моноклональных антител (МКА) [Болтовская М.Н. Роль эндрометриальных белков и клеток-продуцентов в репродукции человека. Дисс. на соискание ученой степени д.б.н., Москва, 2001, с.265; Болтовская М.Н., Старосветская Н.А., Маршицкая М.И., Назимова С.В., Степанов А.А., Шевченко В.В. Получение и практическое использование моноклональных антител против альфа2-микроглобулина фертильности. Бюлл. эсперим. биол. и мед., Москва, 1997, т.124, №9, С.319-322]. Указанный способ позволяет не только определять наличие белка, но и его количественное содержание, а также длительное хранение супернатанта (условия хранения: Т, °С: -4÷-20, две недели). Наличие в содержимом кисты белка АМГФ является диагностическим критерием для оценки характера новообразования, в частности для уточнения диагноза внутрикистозного РМЖ и исключения злокачественного характера новообразования при ФКБ.

АМГФ, плацентарный альфа2-микроглобулин фертильности (гликоделин) представляет собой специфический гликопротеин, обладающий мощной иммуносупрессорной активностью [Dell A., Morris H.R., Easton R.L. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities. J. Biol. Chem., 1995, V.270, N41, Р.24116-24125], влияющий на процессы апоптоза [Mukhopadhyay D., Sundereshan S., Rao C., Karande A.A. Placental protein 14 induces apoptosis in Т cells but not in monocytes. J Biol. Chem., 2001, Jul. 27; 276(30): 28268-73] и ангиогенеза [Song M., Ramaswamy S., Ramachandran S., Flowers L.C., Horowitz I.R., Rock J.A., Parthasarathy S. Angiogenic role for glycodelin in tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Jul. 31; 98(16): 9265-70].

Отличительным признаком способа является впервые установленный диагностический параметр, позволяющий верифицировать диагнозы ФКБ и внутрикистозного РМЖ по факту наличия или отсутствия эндометриального белка АМГФ в ткани молочной железы.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 

Выполнение изобретения по заявленному способу иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Больная Б., 74 лет, обратилась с жалобами на образование в правой молочной железе, появившееся 2 недели назад. При пальпации в преареолярной области определялось образование до 3 см в диаметре, неподвижное. Отмечалась втянутость соска (со слов больной, сосок был втянут «всегда»). Рентгенографически, на фоне фиброзно-жировой инволюции - узловое образование до 2,7 мм в диаметре. При пункции узлового образования (кисты) было получено около 2 мл жидкости, введен воздух. На пневмокистограммах внутрикистозных разрастаний не выявлено. С целью подтверждения доброкачественного характера узлового образования было произведено исследование супернатанта для выявления АМГФ, который обнаружен не был, что позволило исключить РМЖ. При цитологическом исследовании данный вывод был подтвержден. При повторных осмотрах через 3, 6 и маммографии через 12 месяцев узловых образований обнаружено не было, что подтверждает правильность вывода по верификации поставленного диагноза.

Пример 2.

Больная К., 63 лет, обратилась с жалобами на образование в правой молочной железе. При УЗ-исследовании была выявлена киста молочной железы с внутрикистозными разрастаниями, что могло свидетельствовать о внутрикистозном РМЖ. При цитологическом исследовании были обнаружены клетки РМЖ, для подтверждения которого определяли вышеописанным методом наличие АМГФ в содержимом кисты. АМГФ был выявлен, что позволило подтвердить диагноз внутрикистозного РМЖ. Больная была направлена на оперативное лечение, при гистологическом исследовании диагноз был подтвержден. 

Указанным заявленным способом обследовано 186 женщин. Количество ложноположительных результатов составило 15, ложноотрицательных - 2, истинноположительных - 8, истинноотрицательных - 161. Результаты выполнения изобретения по способу верификации обследования женщин представлены в таблице 1.

Выводы по заявленному способу: 

- Чувствительность способа - 80%.

- Специфичность - 91%.

- Прогностическая ценность положительного результата - 35%.

- Прогностическая ценность отрицательного результата - 99%.

- Точность - 91%.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ 

Изобретение может быть использовано в сфере практического здравоохранения, в клинической и лабораторной практике маммологических, онкологических и гинекологических стационаров в качестве самостоятельного метода для уточнения ранних диагнозов патологических состояний молочной железы.

Использование предложенных в заявленном способе новых диагностических параметров верификации ранних диагнозов злокачественных и доброкачественных заболеваний молочной железы позволяет уточнить и правильно установить диагноз уже на начальных этапах обследования, сократить продолжительность и количество инвазивных и оперативных вмешательств на молочной железе, расширить арсенал методик оценки состояния здоровья женщин, что полностью обеспечивает достижение заявленных в изобретении целей, существенно повышает эффективность диагностических мероприятий в целом.

Таблица 1 
Результаты определения АМГФ по заявленному способу верификации диагнозов ФКБ и внутрикистозного РМЖ 
Иммуноферментный анализ (ИФА) Рак в кисте не обнаружен (цитология) Рак в кисте обнаружен (цитология) Итого 
АМГФ не обнаружен

(ИФА) 161 2 163 
АМГФ обнаружен

(ИФА) 15 8 23 
Итого: 176 10 186 

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ верификации ранних диагнозов фиброзно-кистозной болезни и рака молочной железы, включающий цитологическое исследование содержимого кист молочной железы, отличающийся тем, что дополнительно проводят исследование методом твердофазного иммуноферментного анализа содержимого кист молочной железы на наличие в нем эндометриального белка альфа-2 микроглобулина фертильности (АМГФ), при наличии в содержимом кист АМГФ подтверждают цитологический диагноз внутрикистозного рака молочной железы с вероятностью 80%, а при отсутствии АМГФ в содержимом кист молочной железы подтверждают цитологический диагноз фиброзно-кистозной болезни с вероятностью 99%.

Версия для печати
Дата публикации 25.05.2007гг


вверх