СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ГИСТЕРЭКТОМИИ ПРИ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ГИСТЕРЭКТОМИИ ПРИ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ


RU (11) 2310857 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/68 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.12.2007 - нет данных 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(21) Заявка: 2006108570/15 
(22) Дата подачи заявки: 2006.03.20 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2006.03.20 
(45) Опубликовано: 2007.11.20 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ЛЫСЕНКО О.Н. Дифференциально-диагностическая роль плоидометрии при различных клинико-морфологических вариантах гиперпластических процессов в эндометрии. Российский вестник акушера-гинеколога. 2003, №2, с.16-20 ELHAFEY A.S. et al. Computerized image analysis of p53 and proliferating cell nuclear antigen expression in benign, hyperplastic and
malignant endometrium. Arch. Pathol. Lab. Med. 2001, Jul; 125 (7), с.872-879. реф. Найдено из БД PubMed, PMID 11419970. [Найдено 10.11.2006]. [он-лайн]. GERSTEIN A.S. et al. Vascular endothelial growth factor and plasminogen activators in endometrial carcinoma and hyperplasia. Vopr. Onkol. 2003; 49 (6), p.725-729, реф. Найдено из БД PubMed, PMID 14976916. [Найдено 10.11.2006]. [он-лайн] LEE J.S. et al. Expression of vascular endothelial growth factor in the progression of cervical neoplasia and its relation to angiogenesis and p53 status. Anal. Quant. Cytol. Histol. 2003, Dec; 25 (6), p.303-311, реф. Найдено из БД PubMed, PMID 14714296. [Найдено 10.11.2006]. [он-лайн]. MAZUREK A. et al. Evaluation of angiogenesis, p-53 tissue protein expression and serum VEGF in patients with endometrial cancer. Neoplasma. 2004; 51 (3), p.193-197, реф. Найдено из БД PubMed, PMID 15254672. [Найдено 10.11.2006]. [он-лайн] SHAARAWY M. et al. Biomarkers of intrinsic angiogenic and anti-angiogenic activity in patients with endometrial hyperplasia and endometrial cancer. Acta. Oncol. 2001; 40 (4), p.513-518, реф. Найдено из БД PubMed, PMID 11504312. [Найдено 10.11.2006]. [он-лайн].

(72) Автор(ы): Ищенко Анатолий Иванович (RU); Станоевич Ирина Васильевна (RU); Коган Евгений Алтаровна (RU); Кудрина Елена Александровна (RU) 
(73) Патентообладатель(и): Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (RU) 
Адрес для переписки: 119992, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр.2, ММА им. И.М. Сеченова, отдел интеллектуальной собственности 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ГИСТЕРЭКТОМИИ ПРИ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии. Сущность способа: в эндометрии определяют уровень онкомаркеров сосудистого эндотелиального фактора роста и белка Р53. При величине первого более 1 балла и обнаружении второго делают вывод о необходимости гистерэктомии. Использование способа позволяет повысить точность определения показаний к гистерэктомии у женщин с гиперплазией эндометрия, что дает возможность своевременно и обоснованно выполнить гистерэктомию.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии.

Последнее десятилетие, в связи с изменением образа жизни женщин, происходит неуклонный рост гормонозависимой патологии матки, возрастной пик которой приходится на поздний репродуктивный и перименопаузальный период пациенток.

В то же время все больше женщин откладывают выполнение генеративной функции на четвертое-пятое десятилетие жизни, приобретая к этому возрасту груз генитальной патологии.

Таким образом, врачу все чаще необходимо решать вопрос о целесообразности сохранения матки у женщин с гиперпластическими процессами матки (гиперпластические процессы эндометрия, миома матки, внутренний эндометриоз). Решение данной проблемы осложняется тем, что единственный абсолютный критерий диагноза гиперпластического процесса эндометрия - морфологическое заключение - всегда имеет ту или иную степень субъективности в связи с 1) различным опытом патоморфолога, 2) фрагментацией материала, полученного в процессе раздельного диагностического выскабливания, 3) очаговостью изменений в пределах препарата, 4) нередкой скудностью признаков клеточной атипии, являющихся принципиальными для установления диагноза атипической гиперплазии.

Эксперты ВОЗ указывают на необходимость поиска дополнительных критериев диагноза каждого из 4-х морфотипов гиперплазии эндометрия (S.G.Silverberg, R.J.Kurman, F.Nogales et al. // Tumors of the Breast and Female Genital Tract / Eds F.Tavassoli, P.Devilee. - Lyon, 2003. - P.228).

Для раннего выявления предраковых процессов эндометрия Mutter G.L. и соавторы предлагают иммуногистохимическое определение продукта гена PTEN, исчезновение экспрессии которого происходит в 50-70% предраковых гиперпластических изменений эндометрия и предшествует появлению морфологических изменений (Mutter G.L., Baak J.P., Kust G.A. et al. // Molecular identification of latent precancers in histologically normal endometrium. Cancer Res 61:4311-4314 (2001)).

Дементьева М.М. рекомендует дополнять морфологическое исследование соскобов эндометрия оценкой активности Ca2+/Mg2+-зависимой эндонуклеазы с целью определения степени риска перехода гиперплазии эндометрия в карциному и выбора лечебной тактики (М.М.Дементьева. Оценка показателей апоптоза при гиперпластичеаских процессах и раке эндометрия. // Автореф. ... к.м.н., М., 1999).

Наиболее близким к предлагаемому способу определения показаний к гистерэктомии является способ О.Н.Лысенко. Исследователь предлагает использовать оценку плоидности ядер клеток эндометрия для дифференциальной диагностики и выбора тактики лечения вариантов гиперплазии эндометрия, причем плоидность 4,5-6 с указывает на близость к геному карцином эндометрия, что является аргументом в пользу радикальной хирургической тактики ведения (О.Н.Лысенко. Дифференциально-диагностическая роль плоидометрии при различных клинико-морфологических вариантах гиперпластических процессов в эндометрии. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2003, № 2, с.16-20).

Безусловно, появление анеуплоидных клеток с набором хромосом более 4,5 с говорит о приближении генома клеток гиперплазированного эндометрия к злокачественному. Однако наличие анеуплоидных клеток допустимо и в нормальном, негиперплазированном, эндометрии. Помимо этого, уровень пролиферативной активности варьирует от опухоли к опухоли, а проявлением злокачественного потенциала может служить приобретение клетками способности к уклонению от апоптоза, признаков автономного роста и стимуляции неоангиогенеза.

Кроме того, в исследовании О.Н.Лысенко микроспектрофотометрию ядер как основу плоидометрии проводили "на типичных участках гистологического среза", несмотря на то, что тяжесть морфологических изменений не всегда коррелирует со степенью изменений на молекулярном уровне.

Задачей нашего изобретения являлось повышение точности определения показаний к гистерэктомии у женщин с гиперплазией эндометрия для избежания неадекватности проводимого лечения как в сторону недостаточной, так и избыточной радикальности.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что определяют уровень онкомаркеров сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и белка Р53 в эндометрии, и при величине сосудистого эндотелиального фактора роста более 1 балла и обнаружении Р53 делают вывод о необходимости проведения гистерэктомии.

Морфологический тип гиперпластического процесса эндометрия определяли, используя классификацию ВОЗ (1994).

Для гистологического исследования ткани или орган фиксировали в 10% забуференном (фосфатном) нейтральном формалине, подвергали обработке с помощью аппарата гистологической проводки тканей фирмы "Pool Scientific Instruments" (Швейцария) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало 24 часов. Затем с каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм с последующей окраской гематоксилин-эозином.

Затем проводили иммуногистохимическое исследование.

На серийных парафиновых срезах толщиной 4 мкм иммунопероксидазным методом двойных антител (Nadji M., Morales A.R. Immunoperoxidaze techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicogo: ASCP Press 1986) с предварительной демаскировкой антигенов в СВЧ-печи в течение 20 минут выявляли маркеры VEGF и Р53.

Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляли 3% раствором перикиси водорода в депарафинизированных срезах. Использовались покрытые адгезивом (APES-ацетон) стекла.

В качестве первичных специфических антител применяли моноклональные антитела Р53 "ready to use" (Novocastra Laboratories, Великобритания) и VEGF 1:100 (Dako Cytomation, США).

После инкубации срезов с первичными антителами во влажных камерах в течение 16 часов при температуре 4°, их промывали в фосфатном буфере и далее обрабатывали вторичными антителами, после чего инкубировали во влажных камерах при комнатной температуре в течение 60 минут.

В качестве вторичных антител использовали биотинилированные антитела к мышиным иммуноглобулинам. Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали метку - фермент - пероксидазу хрена в присутствии субстрата - пероксида водорода - и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (LSAB, Dako Cytomation). В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде светло-коричневого окрашивания структур клеток.

Для определения локализации антигена в клетках применяли фоновый краситель - гематоксилин.

Ставились негативные контроли с использованием иммуноглобулинов свиньи вместо первичных антител и позитивные контроли на мелкоклеточном, плоскоклеточном раке легкого с изученным содержанием маркеров.

Наличие или отсутствие положительной иммуногистохимической реакции оценивалось в ядрах и цитоплазме эпителиальных и стромальных клеток. Результаты реакций по VEGF выражались в баллах по 6-балльной системе: 1 балл - 5-10% окрашенных клеток, 2 балла - 10-20%, 4 балла - 20-40%, 6 баллов - более 40%. Оценка экспрессии Р53 осуществлялась путем подсчета процента окрашенных ядер на 300 клеток (Lam K.Y., Lo C.Y., Wat N.M.S. et al. Journal of Clinical Pathology. 54: 443-448 (2001)).

В эндометрии фазы пролиферации и простой гиперплазии эндометрия экспрессия Р53 и VEGF отсутствовала.

Комплексная гиперплазия эндометрия без атипии характеризовалась появлением экспрессии VEGF (0,1±0,02 баллов в паренхиме и 0,3±0,01 баллов в строме) и отсутствием иммуногистохимически определяемого (мутантного) Р53.

При комплексной гиперплазии эндометрия с атипией уровень VEGF возрос до 1,13±0,02 баллов в паренхиме и 1,38±0,01 баллов в строме. Появились Р53 положительные клетки как в паренхиме (12,6±0,03%), так и в строме (8,94±0,02%).

Все случаи высокодифференцированного эндометриоидного рака характеризовались высокой экспрессией VEGF (2,7±0,03 в паренхиме и 3,4±0,01 в строме) и Р53 (70,1±2% в паренхиме и 67,2±3% в строме).

Исходя из полученных данных мы считаем целесообразным говорить о дифференциально-диагностическом значении VEGF и Р53.

Положительная иммуногистохимическая реакция на VEGF (1 и более баллов в паренхиме и строме гиперплазированного эндометрия) в сочетании с обнаружением белка Р53, позволяет диагностировать и/или подтвердить атипическую комплексную гиперплазию эндометрия и определяет абсолютные показания для выполнения гистерэктомии.

ПРИМЕР 1

Больная А., 43 года. Обратилась с жалобами на метроррагию. Из анамнеза: беременностей - 4, из них: родов - 2, искусственных абортов - 2. Брак второй, в настоящем браке детей нет.

При ультразвуковом исследовании в первую фазу менструального цикла выявлено увеличение М-эхо до 15 мм. Поставлен предварительный диагноз гиперпластического процесса эндометрия.

Произведена гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание.

Заключение морфолога: атипическая комплексная гиперплазия эндометрия (аденоматозная гиперплазия эндометрия с очагами атипии).

Впервые выявленная аденоматозная гиперплазия эндометрия с очагами атипии не является абсолютным показанием для гистерэктомии, к которой традиционно прибегают при рецидивирующем характере течения заболевания и/или при сочетанной патологии матки (миома матки, аденомиоз). В остальных случаях обычно предпринимаются попытки консервативного (супрессивного гормонального) лечения, по завершении которого проводят контрольную гистероскопию и раздельное диагностическое выскабливание эндоцервикса и эндометрия с обязательным морфологическим исследованием соскобов.

Результаты иммуногистохимического исследования: сосудистый эндотелиальный фактор роста 1,11 балла в паренхиме, 1,37 балла в строме; белок Р53 12,58% в паренхиме, 8,92% в строме.

Несмотря на впервые выявленную гиперплазию эндометрия от консервативного лечения (супрессивной гормональной терапии) решено отказаться, так как определен усиленный неоангиогенез (по экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста) и уклонение клеток эндометрия от апоптоза (по появлению экспрессии Р53). Гормонотерапия могла бы привести к достижению неполного морфологического эффекта или даже "морфологической ремиссии" заболевания, однако свойством восстанавливать измененный генотип клеток она не обладает, что, в данном случае, реализовалось бы в рецидиве заболевания или малигнизации.

Учитывая данные иммуногистохимического исследования, пациентка произведена гистерэктомия (экстирпация матки).

ПРИМЕР 2

Больная Б., 41 год. На момент обращения жалоб не предъявляет. Целью обращения служило "обследование перед планируемой беременностью". Из анамнеза: беременностей - 0, от беременности предохранялась. В браке - 1 год. С 34 лет трижды подвергалась раздельному диагностическому выскабливанию в связи с дисфункциональными маточными кровотечениями. Морфологическим субстратом оказывалась простая гиперплазия эндометрия.

При ультразвуковом исследовании на 6 день менструального цикла выявлена миома матки (1 межмышечный узел диаметром 2,3 см, недеформирующий полость матки) и увеличение М-эхо до 12 мм.

Предварительный клинический диагноз: Миома матки. Гиперпластический процесс эндометрия.

Произведена гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание.

Морфологическое заключение: атипическая комплексная гиперплазия эндометрия (диффузная аденоматозная гиперплазия эндометрия с очагами атипии).

Впервые выявленная диффузная аденоматозная гиперплазия эндометрия с очагами атипии не является абсолютным показанием для гистерэктомии, однако, учитывая рецидивирующий характер течения процесса у женщины позднего репродуктивного возраста была рекомендована экстирпация матки без придатков.

Иммуногистохимическое исследование: сосудистый эндотелиальный фактор роста 1,15 балла в паренхиме, 1,4 балла в строме; белок Р53 12,7% в паренхиме, 8,98% в строме.

Принимая во внимание настойчивое желание женщины с нереализованной генеративной функцией, предпринята попытка супрессивной гормональной терапии (4 инъекции золадекса 3,6 мг, 1 инъекция в 28 дней). Затем произведена контрольная гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание.

Морфологическое заключение: атипическая комплексная гиперплазия эндометрия (очаговая аденоматозная гиперплазия эндометрия с очагами атипии).

Иммуногистохимическое исследование: сосудистый эндотелиальный фактор роста - 1,14 балла в паренхиме, - 1,39 балла в строме; белок Р53 - 13,1% в паренхиме, - 9,2% в строме.

Учитывая желание пациентки и некоторый морфологический эффект консервативной терапии (переход из диффузной аденоматозной в очаговую аденоматозную гиперплазию), назначен второй курс супрессивной гормональной терапии по вышеописанной схеме.

После окончания курса лечения произведена контрольная гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание.

Морфологическое заключение: комплексная гиперплазия эндометрия без атипии (очаговая аденоматозная гиперплазия эндометрия без атипии).

Несмотря на отсутствие признаков клеточной атипии в микропрепаратах, иммуногистохимические показатели не снизились: сосудистый эндотелиальный фактор роста составил 1,13 балла в паренхиме, 1,37 балла в строме; белок Р53 - 13,6% в паренхиме, - 9,5% в строме. Таким образом, на молекулярном уровне, сохраняются усиленный неоангиогенез и уклонение от апоптоза.

Анализируя полученные данные, консилиум повторно рекомендовал произвести пациентке экстирпацию матки без придатков. Вопрос о выполнении генеративной функции возможно решить с помощью вспомогательных репродуктивных технологий.

Ииммуногистохимический метод позволяет диагностировать ту или иную патологию на этапе, когда она еще не проявилась изменением тканевой или клеточной морфологии. Уклонение клеток от апоптоза и усиленный неоангиогенез являются этапами канцерогенеза в эндометрии. Предложенный метод позволяет диагностировать появление и накопление пула подобных клеток до этапа приобретения ими всех свойств злокачественного новообразования, что дает возможность своевременно и обоснованно выполнить гистерэктомию указанному контингенту женщин с гиперплазией эндометрия.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ определения показаний к гистерэктомии при гиперплазии эндометрия путем исследования эндометрия, заключающийся в том, что определяют уровень онкомаркеров сосудистого эндотелиального фактора роста и белка Р53, и при величине первого более 1 балла и обнаружении второго делают вывод о необходимости гистерэктомии.