УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛАГАЛИЩНОЙ МИКРОФЛОРЫ БОЛЬШИХ ГРУПП ЖЕНЩИН

УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛАГАЛИЩНОЙ МИКРОФЛОРЫ БОЛЬШИХ ГРУПП ЖЕНЩИН

RU (11) 2209040 (13) C1

(51) 7 A61B10/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 28.06.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002120061/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.07.29 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.07.29 
(45) Опубликовано: 2003.07.27 
(56) Аналоги изобретения: MADICO G et al. Diagnosis of Trichomonas vagina1is infection by PCR using vagina1 swab samples. J. C1in. Microbiol. 1998; 36(11), р.3205-3210. US 4465078 А, 14.08.1984. US 3850160 А, 26.11.1974. US 3934575 A, 27.01. 1976. RU 2134535 C1, 20.08.1999. RU 2164532 C1, 27.03.2001. CN 1355320 А, 26.06.2002. WO 0181626 A1, 01.11.2001. 
(71) Имя заявителя: Федоров Николай Алексеевич; Ёлов Андрей Александрович; Гришаев Михаил Петрович; Гришаева Ольга Николаевна; Липатникова Стелла Владимировна 
(72) Имя изобретателя: Федоров Н.А.; Ёлов А.А.; Гришаев М.П.; Гришаева О.Н.; Липатникова С.В. 
(73) Имя патентообладателя: Федоров Николай Алексеевич; Ёлов Андрей Александрович; Гришаев Михаил Петрович; Гришаева Ольга Николаевна; Липатникова Стелла Владимировна 
(98) Адрес для переписки: 123182, Москва, ул. Щукинская, 6, корп.2, ЦНИИ ТММТ АМТН, Н.А. Федорову 

(54) УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛАГАЛИЩНОЙ МИКРОФЛОРЫ БОЛЬШИХ ГРУПП ЖЕНЩИН 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, акушерству, диагностике и эпидемиологии урогенитальных инфекций, и может быть применено для профилактических, контрольных и лечебных обследованиях рожениц и других групп женщин. Способ включает взятие биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, при этом взятие материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 часов и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, прекращающим рост бактерий, а при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз для полноты смыва клеток. Технический результат - создана простая беззатратная методика взятия биологического материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры в достаточном объеме без усиления воздействия на обследуемого, а также возможность проведения скрининга влагалищной микрофлоры больших групп женщин. 1 з.п.ф-лы, 2 табл., 2 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, акушерству, диагностике и эпидемиологии урогенитальных инфекций, и может применяться для профилактических, контрольных и лечебных обследованиях рожениц и других групп женщин.

С бактериальной микрофлорой влагалища женщин могут быть связаны не только воспалительные процессы урогенитальных и репродуктивных органов, но и так называемые внутриутробные и постнатальные инфекции новорожденных. Широкий ИФА- и NAT-скрининг в отношении вирусов, передающихся через кровь, уже является состоявшейся практикой во всем мире. Однако NAT-скринирование бактериальной микрофлоры и герпес-вирусов влагалищ женщин затруднен из-за отсутствия простых, стандартных и беззатратных способов получения материала для исследования.

Известные методы забора материала, потенциально содержащего влагалищную микрофлору, состоят во взятии соскобов и мазков со слизистой (например, при помощи шпателей, специальных щеток и скарификаторов) в амбулаторных или больничных условиях (В. М. Лифшиц, В.И. Сидельникова. Медицинские лабораторные анализы. Справочник. М.: Триада-Х, 2000, с. 61-65). При этом эффективность генамплификационного обнаружения бактерий зависит от качества проведения процедуры взятия материала медперсоналом, что в свою очередь зависит также от состояния пациентки в момент обследования. В любом случае вероятным является недостаточный объем материала в соскобе или мазке, что может привести к ложно-отрицательным результатам при небольших степенях инфицирования; попытки же увеличить этот объем связаны с неоправданным усилением воздействия (в том числе и болевого) на обследуемых. Наконец, возможность скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин ограничена необходимостью личного прихода обследуемых в медицинские учреждения.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры путем взятия биологического материала в виде соскоба со слизистой влагалища (Madico G. et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. - Journal of Clinical Microboilogy 1998, v. 36, No. 11, p. 3205-3210). Метод также не позволяет иметь биологический материал для исследования в достаточном объеме и сложен по исполнению для профилактических обследований больших групп женщин.

Целью изобретения является создание простой беззатратной методики взятия биологического материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры в достаточном объеме без усиления воздействия на обследуемого, а также возможности проведения скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин.

Поставленная цель достигается тем, что получение материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры проводят путем взятия биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, при этом взятие биологического материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 часов и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, содержащим 0,9% хлорид натрия и 0,05% азид натрия в воде. Причем при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз.

Способ осуществляется следующим образом.

В полимерные одноразовые контейнеры объемом 20 мл с герметическими завинчивающимися крышками вносят по 10 мл стабилизирующего раствора, имеющего состав: 0,9% хлорида натрия и 0,05% азида натрия в воде. Такие контейнеры с указанным раствором рассылают для сбора проб. Использованный тампон, находящийся в контакте с влагалищем не менее 6 часов, помещают в такой контейнер и плотно завинчивают крышку. После этого флакон маркируют и отправляют на анализ. Пробы перевозят и хранят (накапливают) при обычных температурах без заморозки. Бактериальные клетки пригодны для генодиагностики даже после нескольких недель хранения в таких условиях. При проведении анализа в генодиагностической лаборатории тампон во флаконе 4-5 раз отжимают для полноты смыва клеток. При этом окраска пробы (от крови или выделений) с тампона смывается не полностью, что указывает на частичную сорбцию на нем возможных ингибиторов ПЦР. Далее отбирают 1-1,4 мл жидкой фазы в пробирку типа Эппендорф и центрифугируют 5 мин при 12000 g на настольной микроцентрифуге. Полученный осадок клеток, как правило, достаточно чист от слизи и других компонентов пробы, так что препарат ДНК для ПЦР может быть получен из него простым методом термического лизиса с сорбентом.

Применение таких влагалищных тампонов женщинами в настоящее время широко распространено и рекомендуется, оно полностью безопасно и не связано с болевыми ощущениями. В то же время тампон, находящийся в плотном контакте с обследуемой слизистой в течение длительного времени (несколько часов), собирает в себя выделения вместе с материалом для генодиагностического обследования (микрофлорой и отслоившимся эпителием) в количествах, существенно больших и стабильных, чем при обычных взятиях мазков и соскобов. А содержание затем тампона с собранным материалом в герметически закрытом пластиковом контейнере с жидким консервантом - 0,9% хлоридом натрия и 0,05% азидом натрия в физиологическом растворе прекращает рост бактерий, но хорошо сохраняет их в неразрушенном виде в течение длительного времени. Помещение использованного тампона в заранее приготовленный контейнер составляет всю операцию по взятию материала для генодиагностического обследования, которую можно проводить в любых условиях вне медицинского учреждения, в том числе и самой обследуемой женщиной.

Пример 1. Сохранность бактериальных клеток в стабилизирующем растворе в условиях транспортировки и хранения проб.

Для оценки такой сохранности были взяты клетки бледной трепонемы, которые быстро погибают и не культивируются in vitro. Эти клетки были добавлены в указанный раствор в концентрации 100 клеток в 1 мл. Полученная суспензия была проанализирована методом РНК-ПЦР на рибосомальную 16S РНК (по методике, описанной в патенте РФ 2164532), которая намного менее стабильна, чем ДНК до и после двух месяцев хранения при комнатной температуре. Приведенная на фиг. 1 электрофореграмма результата этого анализа показывает сохранность в этих условиях даже рибосомальной РНК. Другой наш эксперимент (Федоров Е.Н., Петухова И. И. , Суханов Ю.С., Елов А.А., Федоров Н.А. ПЦР-детекция ДНК и РНК Тгероnеmа pallidum в крови серопозитивных доноров. - Вестник службы крови России 2001, 3, с. 42-46) показал, что и в более агрессивной среде - цельной крови - рибосомальная РНК в составе бледной трепонемы стабильна 6 недель при 4oС.

Пример 2. Анализ проб двух пациенток, полученных с использованием тампонов, на хламидии, микоплазму, уреаплазму и трихомонаду.

Пробы на тампонах обработаны по приведенной выше методике. Клеточный осадок был обработан термолизисом 15 мин при 95oС в суспензии фосфоцеллюлозы (аналог обработки Insta Gene фирмы Bio-Rad), экстракт ДНК введен в ПЦР. Для определения возбудителей использованы амплификационные реагенты, изготовленные d cоответствии с патентом РФ 2164532. Из электрофореграммы на фиг.2 видно, что у обеих пациенток обнаружена уреаплазма, а у пациентки 2 - также и хламидия; микоплазма и трихомонада у них отсутствует. Ингибирования ПЦР, несмотря на самый простой метод обработки проб, не наблюдается. В целом при использовании тампонов, как показывает опыт, ингибирование ПЦР, требующее повтора с дополнительной промывкой осадка или использования более сложного выделения ДНК из клеток методом сорбции на силикагеле, наблюдается не чаще, чем при обычной работе с мазками и соскобами. Даже при такой простой обработке в полученном экстракте ПЦР на обычные урогенитальные возбудители проходит достаточно эффективно.

Пример 3. Параллельный анализ проб одних и тех же пациентов, взятых с помощью тампонов и обычных соскобов.

По договоренности с рядом медицинских учреждений врачи-гинекологи наряду с соскобами брали у пациенток на анализ также и влагалищные тампоны (обычно "мини" фирм "Always", "Kou", "Ob"), находившиеся во влагалище 6-10 часов и подготовленные по приведенной выше инструкции. Тампоны и соскобы обрабатывались как в примере 2 и выше, на экстрактах ДНК проведена ПЦР на заказанные врачами инфекции. Результаты обследования 195 человек приведены в таблице 1.

В работе был использован полуколичественный метод оценки результатов ПЦР-анализа по внутреннему стандарту. Для упрощения трактовки результатов во врачебной практике они были переведены в следующую систему оценки:

(+) - 50-500 копий геномов возбудителя на пробу.

(++) - 500-5000 копий геномов возбудителя на пробу.

(+++) - 5000-50000 копий геномов возбудителя на пробу.

(++++) - более 50000 копий геномов возбудителя на пробу.

Сравнение положительных результатов по такому критерию для разных методов забора биоматериала приведено в таблице 2.

Приведенные в примере 3 сопоставление анализов проб одних и тех же пациенток, полученных с помощью обычных соскобов и с использованием тампонов по приведенной выше методике, показал, что при использовании тампонов выявляемость инфекций повышается примерно в два раза и сигналы ПЦР становятся более интенсивными. Это подтверждает эффективность предложенного метода сбора проб влагалищной микрофлоры. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры, включающий взятие биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, отличающийся тем, что взятие биологического материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 ч и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, прекращающим рост бактерий, а при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз для полноты смыва клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве жидкого консерванта в контейнер помещают раствор, содержащий 0,9% хлорид натрия и 0,05% азид натрия в воде.