СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ

RU (11) 2193777 (13) C2

(51) 7 G01N33/483 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 28.06.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.11.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000115664/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.06.15 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.06.15 
(45) Опубликовано: 2002.11.27 
(56) Аналоги изобретения: КОРСАК В.С. Экстракорпоральное оплодотворение в терапии бесплодия. Авт. дисс. докт. мед. Наук. - Спб., 1999, с. 13. RU 2013989 С1, 15.06.1994. RU 2118822 С1, 10.09.1998. US 5693534 А, 02.12.1997. ЗДАНОВСКИЙ В.М. и др. Результаты лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения. - Акушерство и гинекология, 1990, №12, с. 51-53. WANG L. Et AL. Concentrations of immunoreactive interleukin - 1 and interleukin - 2 in human preovulatory follicular fluid. Hum. Reprod., 1992, vol.7, р.147-150. 
(71) Имя заявителя: Ростовский НИИ акушерства и педиатрии 
(72) Имя изобретателя: Сагамонова К.Ю.; Орлов В.И.; Погорелова Т.Н.; Кузьмин А.В.; Ломтева С.В. 
(73) Имя патентообладателя: Ростовский НИИ акушерства и педиатрии 
(98) Адрес для переписки: 344012, г.Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43, РНИИАП, пат. отдел 

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и репродуктологии, и найдет использование в программах ЭКО и ПЭ. Для осуществления способа при пункции фолликулов производят аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости раздельно из правого и левого яичников. В фолликулярной жидкости определяют активность протеолитических ферментов. При уровне пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости не менее 75 мг/мл/ч в одном из яичников прогнозируют благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ. Технический результат - способ прост, точен, атравматичен и позволяет прогнозировать исход программы ЭКО и ПЭ до момента переноса эмбрионов в полость матки. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологи, и может быть использовано в программах ЭКО и ПЭ экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов с целью прогнозирования их исходов.

Современные знания и накопленный за последние два десятилетия опыт лечения бесплодия при стремительном прогрессе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволили достичь значительных успехов в этом направлении. Это стало возможным благодаря внедрению в программу ЭКО усовершенствованных индукторов суперовуляции, позволяющих достичь увеличения количества ооцитов, а также в результате улучшения качества культуральных сред.

В то же время репродуктологи неудовлетворены результатами программ экстракорпорального оплодотворения: частота наступления беременности после применения ЭКО и ПЭ даже в лучших клиниках мира не превышает 30% в расчете на один перенос эмбрионов и 10-15% на один стимулированный цикл (В.И. Кулаков, Б.В.Леонов, 1998).

По всей видимости, эти мероприятия позволили приблизиться к определенному порогу эффективности, в связи с чем весьма актуален поиск новых путей, приводящих к улучшению результативности программ ЭКО и ПЭ.

Одним из путей дальнейшего повышения эффективности программ ЭКО может явиться улучшение качества ооцитов и разработка способов объективного контроля над отбором наиболее полноценных и перспективных для оплодотворения яйцеклеток.

Первые шаги в этом направлении сделаны благодаря внедрению одного из индукторов суперовуляции - рекомбинантного ФСГ, позволяющего увеличить долю зрелых ооцитов без увеличения общего числа последних (Б.В. Леонов, 1999).

Известен способ прогнозирования исходов программы ЭКО, описанный B.C. Корсаком, 1999 г. Сборник научных трудов симпозиума с международным участием (27-28 мая 1999).

Сущность способа состоит в том, что при проведении гонадотропной стимуляции суперовуляции в программах ЭКО перед введением разрешающей дозы хорионического гонадотропина оценивают доплерометрические показатели, характеризующие кровоток в сосудах матки - индекс резистентности (RI), индекс пульсации (PI) и величину конечной диастолической скорости (РК2).

Снижение индекса пульсации (PI) при стабильных значениях индекса резистентности (RI) и конечной диастолической скорости (РК2) в сосудах матки при проведении гонадотропной стимуляции (введением ХГ) является негативным прогностическим признаком в отношении наступления беременности.

Однако данный способ не исключает определенной доли субъективизма при проведении исследования, что может приводить к определенным прогностическим ошибкам.

Известен способ прогнозирования исходов программы ЭКО, описанный в автореферате дисс. к.м.н. А.Ю. Зосимовского, 1997 г.

Сущность способа состоит в том, что при осуществлении программы ЭКО у женщин без аутоиммунных заболеваний проводят диагностику антифосфолипидного синдрома. С этой целью для иммуноморфологического исследования проводят биопсию эндометрия на 8-11 день менструального цикла у женщин, перенесших неудачную попытку экстракорпорального оплодотворения. Материал для иммуноморфологического исследования помещают в жидкий азот, затем готовят серийные срезы толщиной 5 микрон в криостате. Полученные срезы обрабатывают по прямому методу Кунса иммунными люминисцирующими сыворотками против С3 фракции комплемента человека, фибриногена и иммуноглобулинов классов: А, М, G. Интенсивность люминесценции оценивают визуально по трехкрестовой шкале (+ слабая, ++ умеренная, +++ сильная). Определение циркулирующих антифосфолипидных антител в крови проводят иммуноферментным твердофазным методом (Falcon et al., 1991). Циркуляция антифосфолипидных антител приводит к образованию и нарушению элиминации иммунных комплексов у женщин и является неблагоприятным прогнозом исхода экстракорпорального оплодотворения.

Однако данный способ является трудоемким, невозможным для использования и прогноза исхода у женщин с завершенной программой ЭКО. Кроме этого, диагностика, необходимая для выявления антифосфолипидных антител, а также терапия, направленная на элиминацию соответствующих иммунных комплексов, должны выполняться своевременно (на этапе подготовки женщины к программе ЭКО).

Прототипом предлагаемого нами способа избран способ прогнозирования исходов программы ЭКО, описанный в автореферате дисс. д.м.н. B.C. Корсака, 1999 г.

Сущность способа состоит в том, что на этапе индукции суперовуляции вне зависимости от протокола ее проведения в качестве значений ультразвуковых критериев назначения ХГ приняты: средний диаметр большинства фолликулов в когорте, равный 17 мм, и толщина эндометрия 8 мм без ограничения их максимальных значений. Это параметры, определяющие благоприятный прогноз в отношении исхода программы ЭКО, т.е. оказывающие наиболее выраженное влияние на частоту наступления беременности.

Данный способ обладает рядом несовершенств:

- способ не исключает определенной доли субъективизма в измерении УЗ параметров;

- способ не учитывает объективных качественных характеристик преовуляторных ооцитов, полученных из правого и левого яичников;

- способ не учитывает неоднородную готовность эндометрия правой и левой половин матки к приему плодного яйца.

Указанные недостатки могут быть устранены в заявляемом изобретении.

Задача изобретения: разработка объективного и доступного для широкого применения способа прогнозирования исхода беременности, позволяющего провести обоснованный отбор качественных ооцитов с учетом морфофункциональных асимметрий женской репродуктивной системы и по качественным характеристикам фолликулярной жидкости с высокой точностью прогнозировать вероятность наступления беременности в программах ЭКО.

Поставленная задача решается тем, что вне зависимости от проводимой индукции суперовуляции у больной в момент проведения пункции фолликулов производят раздельную аспирацию преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичников, определяют активность протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) в фолликулярной жидкости. При уровне пептид-гидролаз не менее 75 мг/мл прогнозируют благоприятный исход.

В фолликулярной жидкости, полученной из правого и левого яичников, мы определяли активность протеолитических ферментов.

Выбор этой группы ферментов обусловлен их чрезвычайно важной ролью (особенно ограниченного протеолиза) в регуляции различных этапов репродуктивного процесса. Имеются единичные работы, описывающие участие пептид-гидролаз в разрушении фолликулярной стенки, последующей овуляции, а также в других уровнях регуляции менструального цикла (В.Ф. Нагорная, 1990).

Активность протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) в фолликулярной жидкости мы оценивали по нарастанию кислоторастворимых фолинположительных соединений.

Результаты исследования пептид-гидролаз свидетельствуют о том, что у пациенток с преобладанием функциональной активности правого яичника (праводоминантные) в фолликулярной жидкости, аспирированной из правого яичника активность пептид-гидролаз составила в среднем 106,26,4 мг/мл за 1 ч, в фолликулярной жидкости левого яичника - 46,73,1 мг/мл/ч. У пациенток с леводоминантным яичником активность пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости правого яичника была, напротив, в 1,5 раза ниже аналогичных величин в жидкости, взятой из фолликулов левого яичника (77,34,3 мг/мл/ч) и составила 52,64,8 мг/мл/ч.

В фолликулярной жидкости пациенток без выраженного доминирования одного из яичников (амбилатеральные) средняя активность пептид-гидролаз не зависела от стороны ее аспирации (43,03,8 мг/мл/ч и 43,53,4 мг/мл/ч), хотя у отдельных пациенток наблюдалась тенденция к увеличению протеолитических ферментов в фолликулах правого или левого яичников.

Результаты исходов программ ЭКО и ПЭ во всех случаях, когда максимальная активность пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости была менее 75 мг/мл/ч независимо от стороны расположения функционально активного яичника были неблагоприятными.

Таким образом, полученные нами данные обнаруживают четкую зависимость между ферментативной активностью фолликулярной жидкости, доминированием одного из яичников и исходом программы ЭКО и ПЭ. Выявленные различия, очевидно, связаны с обеспечением наиболее благоприятных условий для развития ооцитов доминантного яичника в связи с важной ролью пептид-гидролаз в обновлении тканевых белков, а также участием в процессах фолликулогенеза.

Сопоставительный анализ результатов биохимических исследований с визуальной оценкой яйцеклеток, аспирированных из доминантного яичника, свидетельствует о большей информативности вышеописанной методики в оценке качества ооцитов и обоснованности отбора полноценных яйцеклеток (созревших в оптимальной метаболической среде) для дальнейшего культивирования и подготовки к возможной криоконсервации.

Пример 1.

Больная Г-р, история болезни 3432/65, поступила в Центр репродукции человека с целью проведения ей программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляет жалобы на бесплодие в течение 11 лет. Из анамнеза известно, что больная в 1989 г. перенесла операцию по поводу СПКЯ (без эффекта), а в 1998 г. лапароскопию по поводу спаечного процесса органов малого таза 3-4 степени, двустороннего сальпингита. Несмотря на проведенный объем операции - разъединение спаек органов малого таза и брюшной полости, сальпонгоовариолизиса, восстановить проходимость маточных труб не удалось.

При дополнительном обследовании эндокринологом выявлены: гипоталамический синдром; гипофункция яичников; галакторея. Проведена коррекция эндокринных нарушений.

На этапе обследования перед программой ЭКО выявлен уреаплазмоз, проведено противовоспалительное лечение (с эффектом).

На фоне стимуляции суперовуляции (Хумегон 75ЕД+75ЕД 12 ампул, кломифенцитрат по 100 мг в сутки 5 дней), момент назначения ХГ определяли в зависимости от срока достижения лидирующим фолликулом диаметра не менее 18 мм или 2-3 фолликулами не менее 17 мм. Овуляторная доза Прегнила составила 10 тысяч ЕД.

При УЗ исследовании на момент проведения пункции фолликулов было зарегистрировано 5 лидирующих фолликулов в левом яичнике и 2 в правом. Толщина эндометрия составила 9 мм.

Аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости производят через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ раздельно из правого и левого яичника. С целью получения ооцитов и фолликулярной жидкости из фолликулов яичников производят трансвагинальную пункцию с помощью влагалищного пункционного датчика с частотой 5 MГц ультразвукового аппарата Aloka SSD-500.

Больной была произведена пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости. При пункции фолликулов из левого яичника было получено 3 ооцита, из правого яичника 1.

Полученные преовуляторные ооциты из правого и левого яичников культивируют в специальных термостатах при температуре 37 градусов Цельсия при смеси 5% СO2 в воздухе в питательной среде Менезо В2.

В фолликулярной жидкости, аспирированной в момент пункции правого и левого яичников, определяют активность протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) по нарастанию кислоторастворимых фолинположительных соединений. Субстратом для определения активности ферментов служит лиофилизированный гемоглобин.

Фолликулярную жидкость наливают в 2 пробирки по 1 мл (контрольную и опытную) и в них добавляют по 0,5 мл 1% раствора лиофилизированного коммерческого гемоглобина, приготовленного на ацетатном буфере (0,2 М СН3 COONA и 0,2 М СН3 СООН) рН 4,2. После этого в контрольную пробу приливают 1,5 мл 10% раствора ТХУ, а опытную помещают в термостат при температуре 37oС на 1 час и по окончании инкубации прибавляют 1,5 мл 10% ТХУ. Затем пробы центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. По 1,5 мл центрифугата переносят в опытную и контрольную пробирки, куда добавляют по 0,16 мл 10% раствора NaOH, после чего отбирают по 0,4 мл содержимого, в котором определяют концентрацию кислоторастворимых продуктов (тирозина) протеолитического гидролиза гемоглобина. К нейтрализованному центрифугату в каждую пробирку приливают по 2 мл рабочего раствора реагента, который представляет собой смесь 0,25 л 2% раствора карбоната натрия в 0,1 М раствора гидроксида натрия и 0,01 л 0,5% раствора сульфата меди в 1% растворе цитрата натрия (данная смесь готовится перед анализом). Перемешанное содержимое выдерживают при комнатной температуре (18-25oС) в течение 10 минут, после чего приливают 0,2 раствора Фолина-Чокальтеу и опять после тщательного перемешивания пробы выдерживают в течение 20 минут при комнатной температуре (18-25oC).

Измерение оптической опытной пробы проводят против контрольной пробы в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 750 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре.

Расчет осуществляют по предварительно построенному калибровочному графику. Результаты выражают в МКГ тирозина на 1 мл фолликулярной жидкости.

Уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 20,8 мг/мл/ч, правого - 9,6 мг/мл/ч, что было расценено нами как плохое качество ооцитов и дало возможность прогнозировать крайне неблагоприятный исход в отношении исхода программы ЭКО.

Сперму подвергают флотированию и центрифугированию, после чего оценивают ее фертильность и производят инсеминацию ооцитов.

Перенос эмбрионов в полость матки осуществляют, как правило, через 48-50 часов после трансвагинальной пункции. Эмбрионы на стадии 2-8 бластомеров с помощью специального одноразового катетера для трудного подведения фирмы "COOK" (Австралия) через цервикальный канал переносят в полость матки.

2 из 3 эмбрионов, полученных при пункции левого яичника на стадии 2 бластомеров, перенесли в полость матки.

Результатом описанной попытки ЭКО и ПЭ явилось отсутствие факта наступления беременности у данной пациентки.

Пример 2. Больная К-а, история болезни 5138/32, поступила в Центр репродукции человека с целью проведения ей программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляла жалобы на бесплодие в течение 19 лет. Из анамнеза известно, что больной в 1988 г. была произведена лапароскопическая операция, не выявившая патологии со стороны маточных труб. Учитывая данные лапароскопии и выявленную в результате обследования гипофункцию яичников (гиперэстрогению), негативный ПКТ, больной после предварительной гормональной коррекции были произведены 5 попыток ИИСМ (без эффекта).

Отсутствие эффекта от проводимой терапии потребовало дальнейшего углубленного обследования. При повторной лапароскопии в 1998 г. был установлен диагноз: эндометриоз 2 степени. Произведена коагуляция эндометриоидных гетеротопий, проведено лечение дановалом в течение 1/2 года. При отсутствии эффекта от проводимой терапии больной рекомендована программа ЭКО и ПЭ.

Стимуляция суперовуляции проводилась Декапептилом по 0,1 мг со 2 по 10 день менструального цикла, Хумегоном 75 ЕД+75 ЕД 24 ампулы со 2 по 7 день МЦ. При достижении зрелости фолликулами на 10 день МЦ был назначен Прегнил 10000 ЕД.

При УЗ исследовании на момент проведения пункции фолликулов было зарегистрировано 4 лидирующих фолликула в левом яичнике и 3 в правом. Толщина эндометрия составила 11 мм.

Больной была произведена пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости. При пункции фолликулов из левого яичника было получено 3 ооцита, из правого яичника 1.

В фолликулярной жидкости, аспирированной из левого и правого яичников, определили активность протеолитических ферментов по вышеописанной методике. Уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 69 мг/мл/ч, правого - 1,6 мг/мл,/ч, что было расценено нами как среднее качество ооцитов, при котором не исключен факт наступления беременности после программы ЭКО.

Перенос 3 эмбрионов, полученных при пункции левого яичника на стадии 8 бластомеров, перенесли в полость матки.

Результатом проведенной программы ЭКО и ПЭ явилась беременность, подтвержденная УЗ и гормональным исследованиями, однако в 6 недель у больной произошел самоаборт (гистоанализ 3241 - плодное яйцо с выраженной лимфоцитарной реакцией).

Пример 3.

Больная Н-о, история болезни 518/50, поступила в центр репродукции человека с целью проведения программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляла жалобы на бесплодие в течение 2 лет. В анамнезе больной в 1990 г. неразвивающаяся беременность, в 1996 г. - самоаборт в сроке 15-16 недель, осложнившийся эндомиометритом, в 1998 г. - правосторонняя трубная беременность (правосторонняя тубэктомия).

Стимуляция суперовуляции проводилась с использованием Хумегона 75 ЕД+75 ЕД 11 ампул, кломифенцитрат по 100 мг в сутки 5 дней, овуляторная доза Прегнила составила 8000 ЕД.

При УЗ исследовании на момент проведения пункции фолликулов было зарегистрировано 9 лидирующих фолликулов в левом яичнике и 6 - в правом. Толщина эндометрия составила 8,5 мм.

Больной была произведена пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости. При пункции фолликулов из левого яичника было получено 9 ооцитов, из правого яичника - 6.

В фолликулярной жидкости, аспирированной из левого и правого яичников, определили активность протеолитических ферментов по вышеописанной методике. Уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 145,9 мг/мл/ч, правого - 15,6 мг/мл/ч, что было расценено нами как хорошее качество ооцитов левого яичника, при котором прогноз в отношении наступления беременности после программы ЭКО и ПЭ благоприятный.

Перенос 4 эмбрионов, полученных при пункции левого яичника на стадии 8 бластомеров, перенесли в полость матки.

Результатом проведенной программы ЭКО и ПЭ явилась беременность, завершившаяся рождением доношенного ребенка.

По заявляемой методике проведено ЭКО и ПЭ 66 пациенткам.

Показаниями к проведению программы ЭКО у данного контингента больных явились: трубно-перитонеальное бесплодие (n=23), одно- и двухсторонние тубэктомии (n=23), резекции яичников и односторонние аднексэктомии в сочетании с трубно-перинатальным бесплодием (n= 10), эндометриоз (n= 7), гипофункция яичников (n=2) и бесплодие неясного генеза (n=1).

Из обследуемого контингента больных уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости одного из яичников выше 75 мг/мл/ч был выявлен у 22 пациенток и свидетельствовал о хорошем качестве ооцитов и благоприятном прогнозе в отношении наступления беременности. В этой группе у 19 больных наступила беременность (у 11 завершилась родами, у 8 продолжает развиваться), у 3 не наступила. Уровень пептид-гидролаз 40-74 мг/мл/ч был выявлен у 9 женщин и свидетельствовал о среднем качестве ооцитов. В этой группе у 5 больных беременность завершилась самоабортом, у 1 продолжает развиваться, у 3 беременность не наступила. Уровень пептид-гидролаз менее 40 мг/мл/ч был выявлен у 35 больных и свидетельствовал о неблагоприятном прогнозе в отношении наступления беременности. В этой группе у 1 пациентки диагностирована неразвивающаяся беременность, у 1 самоаборт. У остальных признаков беременности выявлено не было.

Таким образом, заявляемый способ является более эффективным по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

- обеспечивает высокую точность прогноза;

- объективен и прост в исполнении;

- не имеет осложнений и противопоказаний;

- может широко использоваться в центрах репродукции человека в программах ЭКО и ПЭ. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ путем качественной и количественной оценки содержимого фолликулов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости, аспирированной раздельно из правого и левого яичников, исследуют активность пептид-гидролаз и при ее уровне не менее 75 мг/мл/ч в одном из яичников прогнозируют благоприятный исход.