Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям

Главным недостатком большого числа известных в мире онкоэпидемиологических исследований является отсутствие комплексности при оценке влияния многих факторов риска опухолей. Если одни авторы основное внимание уделяют средовым факторам риска, то другие, наоборот, сосредотачивают его на генетических особенностях организма. Вместе с тем, исходя из мультифакторной теории рака, оценка предрасположенности к ЗН должна учитывать оба эти компонента факторов риска.

Одним из наиболее важных, но и наименее изученных вопросов является оценка роли генотипа в развитии различных злокачественных опухолей. Результаты многочисленных исследований однозначно свидетельствуют о существовании генетической предрасположенности к ряду онкологических синдромов, имеющих четко выраженный наследственный характер. Что же касается наиболее распространенных в человеческой популяции новообразований, таких как рак легких, желудка и молочной железы, то малоизученными остаются причины сходства и различий в механизмах генетической предрасположенности к данным типам рака. Имеющиеся в настоящее время сведения не дают пока оснований для однозначного суждения по следующим вопросам, а именно:

- существует ли генетическая предрасположенность к указанным новообразованиям и если существует, то каковы критерии ее оценки;

- одинаковы ли они для раков разной локализации;

- насколько велик вклад генетического компонента в формировании предрасположенности к развитию опухолей среди других факторов риска?

Стандартный способ диагностики предрасположенности к онкозаболеваниям включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР),ферментативного гидролиза эндонуклеазами, электрофорез. Температурный режим ПЦР состоит из следующих этапов: начальное плавление, ряд последовательных циклов из плавления, отжига и синтеза, а также финального синтеза. Используются следующие реагенты: 67 мМ трис-HCI, pH 8,8 при 25°C; 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6,7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 170 мкг БСА, смесь четырех dNTP в концентрации 1,0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза 0,2 ед/мкл (см. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA, 1989, p.5.3-5.31, 6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19).

Недостатком этого способа является то, что с помощью его можно анализировать только одну мутацию или полиморфизм. Он не позволяет осуществить одновременный анализ сразу нескольких генов, что приводит к замедлению процесса диагностики, увеличению трудозатрат и усложнению рабочего протокола.

Также его недостатком является высокая стоимость и возможность проводить его только в специализированных лабораториях.

Известен способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы, см. патент РФ  2280079.

Способ позволяет быстро и с большой достоверностью и надежностью определять предрасположенность к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы. Проводят исследование гена GP3a, при этом при обнаружении в нем сочетания аллелей PL-A1 и PL-A2 устанавливают предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в том числе к инвазивным и метастатическим формам. А исследования гена GP3a осуществляют путем выделения ДНК методом полимеразной цепной реакции, причем ген исследуют в сухой капле крови на бумажном носителе и в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции используют 5'gctccaatgtacggggtaaa и 5'ctcctcagacctccaccttg, синтезируют ДНК-продукт длиной 384 нуклеотидных пары, который расщепляют рестриктазой Mspl, образуя фрагменты ДНК, при этом идентифицируют аллель PL-A1 по фрагментам длиной 290 и 80 нуклеотидных пар, а аллель PL-A2 по фрагментам длиной 175, 120 и 80 нуклеотидных пар.

Недостатком данного способа является его узкая направленность, что ограничивает его применение.

Известны способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления, см. патент  2296328 - прототип.

Заявленный способ и универсальный диагностический набор (ДН) предназначены для проведения медико-генетического анализа сразу нескольких мутаций (полиморфизмов) разных генов, в том числе генов, ассоциированных с некоторыми частыми мультифакториальными заболеваниями. Вследствие использования стандартных компонентов смеси и стандартных олигопраймеров, оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) скорость анализа сокращается до 2-3 дней. Изобретение обеспечивает упрощение, удешевление анализа и делает его пригодным для проведения молекулярных исследований как в специализированных центрах, так и в лабораториях широкого спектра.

К недостаткам (при всех его достоинствах) можно отнести высокую сложность диагностики предрасположенности (восемь этапов проведения), отсюда высокая стоимость. Также этот способ может быть применен только в специально оборудованных лабораториях.

В основу изобретения положена задача создания универсального способа определения предрасположенности при минимальных трудозатратах и стоимости и с вероятностью определения, близкой к единице.

Для решения поставленной задачи предлагается «Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям», основанный на распознавании образов и включающий сканирование обеих ладоней пациента, обработку полученных данных и выявление параметров дерматоглифической картины: на фалангах пальцев - тип узора и гребневой счет; на ладонях - гребневой счет ab, bc, cd; величина угла atd, направление окончания главных ладонных линий А, В, С и Д в ладонные поля; расположение ладонных и осевых трирадиусов; характер рисунков на тенаре, гипотенаре и в межпальцевых полях; при этом на 2 и 3 пальцах правой руки ульнарная петля, на 4 пальце правой руки и на 2 пальце левой руки завиток или двойная петля, в зоне между 3 и 4 пальцами левой руки нет рисунка, ладонный гребневой счет ab правой руки до 31, ладонный гребневой счет cd левой руки от 13 до 30, направление главной ладонной линии D правой руки и счет cd левой руки в 11 поле, величина гребневого счета на 2 пальце счет cd левой руки до 12, на 2 пальце правой руки до 10, на 3 пальце правой руки от 6 до 16, I тип расположения ладонных линий правой руки, узкие ладонные линии правой руки и счет cd левой руки, наличие петли с дополнительным трирадиусом между 2 и 3 пальцами правой руки, наличие петли между 1 и 2 пальцами и петли между 2 и 3 пальцами на счет cd левой руки, карпальное или центральное положение осевого трирадиуса, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку легких; если же количество ладонных линий правой руки и счет cd левой руки от 5 до 10, ширина их нитевидная, величина гребневого счета на 5 пальце счет cd левой руки до 13, на 4 пальце правой руки до 16, на 4 пальце счет cd левой руки до 19, на 5 пальце правой руки до 11, а 2 пальце правой руки до 8 или от 12 до 18, общий гребневой счет на пальцах счет cd левой руки до 67, наличие на 1 и 2 пальцах правой руки ульнарной петли, завитка на 3 и 4 пальцах правой руки и на 5 пальце счет cd левой руки, II и V тип расположения ладонных линий счет cd левой руки, отсутствие рисунка в зоне между 4 и 5 пальцами правой руки и счет cd левой руки, направление главной ладонной линии А счет cd левой руки в 5 поле и линии В счет cd левой руки в поле 5 или 5*, наличие на 4 пальце правой руки арки или завитка, на тенаре правой руки карпальная петля или следы рисунка, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку желудка; если же количество ладонных линий счет cd левой руки от 5 до 10, нет рисунка между 3 и 4 пальцами правой руки, петля между 4 и 5 пальцами правой руки, ульнарная петля на 1 и 2 пальцах правой руки и счет cd левой руки, арка или завиток на 3 пальце счет cd левой руки, промежуточное или боковое положение осевого трирадиуса правой руки, величина ладонного гребневого счета ab до 34 и bc до 22 правой руки, и cd счет cd левой руки до 20, гребневой счет на 2 пальце счет cd левой руки до 14, на 2 пальце правой руки до 16, на 3 пальце правой руки до 8 и от 12 до 18, на 4 пальце правой руки до 9 или 20-24, общий гребневой счет на пальцах правой руки до 40 или от 60 до 90, радиальная петля на тенаре и завиток на гипотенаре правой руки, окончание главной ладонной линии D правой руки в 7 поле, линии В правой руки и счет cd левой руки в 5 или 9 поле, линии А правой руки и счет cd левой руки в 3 или 13 поле, также направление главной ладонной линии С правой руки и редукция ладонных трирадиусов правой руки, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку молочной железы, при анализе общей предрасположенности к развитию онкологических заболеваний учитывается комплекс генетических и негенетических факторов, вероятность развития онкологических заболеваний повышается при наличии: генетической предрасположенности, экологического загрязнения места проживания и места работы, наличии рака у ближайших родственников, вредных привычек - курения и употребления алкоголя, и с увеличением возраста; причем степень риска заболевания раком легких также повышается у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронические неспецифические заболевания легких, туберкулез; степень риска заболевания раком желудка повышается также у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронический гастрит, язвенную болезнь желудка, часто употребляющих острую и жирную пищу; вероятность заболевания раком молочной железы повышается при наличии в анамнезе хронических гинекологических заболеваний, при увеличении количества искусственных и самопроизвольных абортов, увеличении количества беременностей и уменьшении количества родов, увеличении возраста начала mensis и снижении возраста начала менопаузы.

При выявлении предрасположенности к раку легких учитываются следующие дерматоглифические признаки и их информативность (табл.1)

при выявлении предрасположенности к раку желудка учитываются следующие дерматоглифические признаки и их информативность (табл.2)

при выявлении предрасположенности к раку молочной железы у женщин учитываются следующие дерматоглифические признаки и их информативность (табл.3)

в качестве негенетических факторов предрасположенности к раку легких учитываются следующие признаки и их информативность (табл.4)

в качестве негенетических факторов предрасположенности к раку желудка учитываются следующие признаки и их информативность (табл.5)

в качестве негенетических факторов предрасположенности к раку молочной железы у женщин учитываются следующие признаки и их информативность (табл.6)

При анализе общей предрасположенности к развитию онкологических заболеваний учитывается комплекс генетических и негенетических факторов, вероятность развития онкологических заболеваний повышается при наличии: генетической предрасположенности, экологического загрязнения места проживания и места работы, наличии рака у ближайших родственников, вредных привычек - курения и употребления алкоголя, и с увеличением возраста; причем степень риска заболевания раком легких также повышается у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронические неспецифические заболевания легких, туберкулез; степень риска заболевания раком желудка повышается также у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронический гастрит, язвенную болезнь желудка, часто употребляющих острую и жирную пищу; вероятность заболевания раком молочной железы повышается при наличии в анамнезе хронических гинекологических заболеваний, при увеличении количества искусственных и самопроизвольных абортов, увеличении количества беременностей и уменьшении количества родов, увеличении возраста начала mensis и снижении возраста начала менопаузы.

Под индивидуальной предрасположенностью понимается вероятность заболевания для конкретного человека. Оценка индивидуальной предрасположенности производится на основе числового вектора, содержащего указанные данные. Степень генетической предрасположенности к соответствующему заболеванию оценивается предварительно с помощью дерматоглифического вектора и включается в средовой вектор в качестве отдельного признака. Общая размерность средового вектора - 24. В том числе сюда входят 3 признака, отражающие степень генетической предрасположенности к РЛ, РЖ и РМЖ, Таким образом, оценка генетической предрасположенности - первый этап анализа, оценка индивидуальной предрасположенности - второй.

Оценка предрасположенности, как генетической, так и индивидуальной, производится с помощью специальных решающих правил (математических моделей), которые предварительно строятся на основе принципов обучения по прецедентам с использованием математических методов распознавания образов и соответствующих программных средств. При этом используются специальные обучающие выборки.

Данная система оценки предрасположенности к онкозаболеваниям не предусматривает построение решающих правил, она использует уже готовые решающие правила, полученные в результате ранее проведенных исследований.

Общий порядок работы:

1. Каждому обследуемому присваивается индивидуальный регистрационный номер.

2. С помощью программы «Дерматоглифика» производится сканирование пальцевых и ладонных рисунков, их расшифровка и формирование массива данных. Каждому обследованному в массиве данных соответствует одна строка. Для последующего анализа весь накопленный массив или часть его могут быть экспортированы в отдельный файл на диске.

Порядок работы с программой «Дерматоглифика» изложен в отдельной инструкции.

3. Сбор недерматоглифической («средовой») информации об обследуемом и оценка его предрасположенности к заболеваниям РЛ, РЖ и РМЖ производятся с использованием программы «Анализ».

Решение задачи распознавания индивидуальной предрасположенности к раку легкого, желудка и молочной железы на основе комплекса, объединяющего генетические и негенетические факторы, показало, что именно такая их совокупность позволяет получить наиболее надежные решающие правила, то есть наиболее полно описать различия между «образами» заболевших и не заболевших раком.

В результате сравнительной оценки силы влияния факторов, входящих в исследуемые комплексы, установлено, что важное (а для рака желудка и молочной железы наибольшее) значение имеет генотип предрасположенности к соответствующему виду ЗН. Вместе с тем результаты исследований свидетельствуют о том, что наличие подобного генотипа не приводит с неизбежностью к заболеванию, а избирательность его возникновения связана с неблагоприятным сочетанием у конкретных индивидуумов генетических и негенетических факторов риска.

Сравнение результатов трех исследований показало их значительное совпадение. Такое воспроизведение делает их итоги более надежными, кроме того, это позволяет сделать вывод об эффективности применяемых методических подходов.

В предлагаемом изобретении рассмотрены только способы оценки предрасположенности к трем наиболее распространенным формам онкологических заболеваний. Данную методику (способ) можно распространить и на другие формы после выполнения соответствующих исследований с целью получения решающих правил.

Практические результаты

Было обследовано 58 больных раком легких и 71 больной раком желудка и две соответствующие контрольные группы. Для элиминации влияния известных факторов онкологического риска при формировании контрольных групп был использован способ направленного подбора, с учетом попарного выравнивания по следующим шести признакам: пол, возраст, национальность, курение, употребление алкоголя, место работы. По другим факторам риска направленного выравнивания не проводилось, однако и их среднегрупповые значения были весьма близки.

У каждого из 116 человек в исследовании по раку легких и 142 человек в исследовании по раку желудка были получены пальцевые и ладонные отпечатки и проведено типирование HLA антигенов. Типирование HLA антигенов локусов А и В проводилось по стандартной методике. Всего в исследовании по раку желудка было определено 28 антигенов, а в исследовании по раку легких 27. К ним добавлялся признак, характеризующий количество антигенов, обнаруженных у каждого индивидуума.

Поскольку в результате этих исследований было установлено, что характер дерматоглифической картины является более адекватным маркером генетической предрасположенности к ЗН, чем комплекс антигенов HLA, при аналогичном анализе, проводившемся применительно к раку молочной железы у женщин, нами использовалась только дерматоглифика. Исходя из тех же принципов, что и в указанных в работах по раку легких и желудка, здесь для выявления генетической предрасположенности к раку молочной железы было подобрано 65 "копий-пар", уравновешенных по следующим признакам: возраст, национальность, место работы, возраст при первых родах, число доношенных беременностей, число абортов.

После того как исследованиями первого этапа было доказано наличие генетической предрасположенности к ЗН трех рассматриваемых локализаций, возникла задача анализа всего комплекса, включающего в себя как генетические, так и негенетические факторы риска. Из числа жителей г.Первоуральска было подобрано 154 человека больных раком легких, 169 человек больных раком желудка, 150 женщин больных раком молочной железы (табл.7).

К первым двум группам в качестве контроля было подобрано по 200 человек без онкологических заболеваний; в исследованиях же по раку молочной железы контрольная группа составила 121 женщину. Во всех трех случаях контрольные группы формировались с учетом сложившейся половозрастной структуры, а также структуры работающих на разных предприятиях города (39,1% - работники или бывшие работники Новотрубного завода, 6,4% - работники предприятия по выпуску динасовых огнеупоров, 5,8% - работники по выпуску хромовых солей и 47,8% - работники прочих предприятий и организаций города).

Каждый из 354 человек в исследовании по раку легких характеризовался комплексом из 11 показателей, приведенных в нижеследующей таблице номера с 1 по 11, отражающих известные факторы риска для ЗН данной локализации.

Каждый из 369 человек в исследовании по раку желудка характеризовался комплексом из 12 показателей, приведенных в таблице номера с 1 по 9 и с 12 по 14, отражающих известные факторы риска ЗН желудка.

Каждая из 271 женщин в исследовании по раку молочной железы характеризовалась комплексом показателей, приведенных в таблице номера 1, с 3 по 9, с 15 по 21.

Основная часть приведенных в таблице факторов риска не нуждается в каком-либо объяснении. Комментария требуют лишь четыре из них. Степень экологического загрязнения в районе проживания оценивалась нами по данным исследований, выполненных Институтом промышленной экологии УрО РАН, а также по материалам Первоуральского Центра Госсанэпиднадзора. К разряду "сильное" загрязнение были отнесены участки территории города с загрязнением почвы и снежного покрова выше 10 ПДК по 30 основным загрязняющим веществам. Остальная часть города считалась "умеренно" загрязненной.

Установление градаций показателя "употребление алкоголя" базировалось на известной классификации Лисицина Д.П. и Копыта Н.Я. Возраст устанавливался для "больных" на момент постановки диагноза ЗН, а для "здоровых" на момент проведения исследования.

Что касается признака "этническая принадлежность", учитывая тот факт, что в Уральском регионе основная часть населения представлена в основном лицами двух национальных групп (русские и татары), нам представлялось необходимым учесть это обстоятельство, тем более что в литературе имеется значительное число сообщений об особенностях развития ЗН у лиц различных рас и этнических групп.

На основании дерматоглифических критериев, выработанных на первом этапе исследований применительно к ЗН каждой их трех рассматриваемых локализаций, каждый включенный в исследуемые группы индивидуум характеризовался дополнительным признаком "генетически предрасположен к раку соответствующей локализации". Альтернативное значение этого признака ("да" или "нет") основывалось на многофакторной оценке дерматоглифической картины и осуществлялось с помощью выработанных решающих правил.

В предлагаемом изобретении рассмотрены только три предрасположенности наиболее распространенным формам онкологических заболеваний. Естественно, что данную методику (способ) можно распространить и на другие формы, проделав соответствующие исследования.

Формула изобретения

Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям, основанный на распознавании образов и включающий сканирование обеих ладоней пациента, обработку полученных данных и выявление параметров дерматоглифической картины: на фалангах пальцев - тип узора и гребневой счет; на ладонях - гребневой счет ab, bc, cd; величина угла atd, направление окончания главных ладонных линий А, В, С и Д в ладонные поля; расположение ладонных и осевых трирадиусов; характер рисунков на тенаре, гипотенаре и в межпальцевых полях; при этом на 2 и 3 пальцах правой руки ульнарная петля, на 4 пальце правой руки и на 2 пальце левой руки завиток или двойная петля, в зоне между 3 и 4 пальцами левой руки нет рисунка, ладонный гребневой счет ab правой руки до 31, ладонный гребневой счет cd левой руки от 13 до 30, направление главной ладонной линии D правой руки и левой руки в 11 поле, величина гребневого счета на 2 пальце левой руки до 12, на 2 пальце правой руки до 10, на 3 пальце правой руки от 6 до 16,1 тип расположения ладонных линий правой руки, узкие ладонные линии правой руки и левой руки, наличие петли с дополнительным трирадиусом между 2 и 3 пальцами правой руки, наличие петли между 1 и 2 пальцами и петли между 2 и 3 пальцами на левой руке, карпальное или центральное положение осевого трирадиуса, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку легких; если же количество ладонных линий правой руки и левой руки от 5 до 10, ширина их нитевидная, величина гребневого счета на 5 пальце левой руки до 13, на 4 пальце правой руки до 16, на 4 пальце левой руки до 19, на 5 пальце правой руки до 11, а 2 пальце правой руки до 8 или от 12 до 18, общий гребневой счет на пальцах левой руки до 67, наличие на 1 и 2 пальцах правой руки ульнарной петли, завитка на 3 и 4 пальцах правой руки и на 5 пальце левой руки, II и V тип расположения ладонных линий левой руки, отсутствие рисунка в зоне между 4 и 5 пальцами правой руки и левой руки, направление главной ладонной линии А левой руки в 5 поле и линии В левой руки в поле 5 и 5*, наличие на 4 пальце правой руки арки или завитка, на тенаре правой руки карпальная петля или следы рисунка, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку желудка; если же количество ладонных линий левой руки от 5 до 10, нет рисунка между 3 и 4 пальцами правой руки, петля между 4 и 5 пальцами правой руки, ульнарная петля на 1 и 2 пальцах правой руки и левой руки, арка или завиток на 3 пальце левой руки, промежуточное или боковое положение осевого трирадиуса правой руки, величина ладонного гребневого счета ab до 34 и bc до 22 правой руки, и cd левой руки до 20, гребневой счет на 2 пальце левой руки до 14, на 2 пальце правой руки до 16, на 3 пальце правой руки до 8 и от 12 до 18, на 4 пальце правой руки до 9 или 20-24, общий гребневой счет на пальцах правой руки до 40 или от 60 до 90, радиальная петля на тенаре и завиток на гипотенаре правой руки, окончание главной ладонной линии D правой руки в 7 поле, линии В правой руки и левой руки в 5 или 9 поле, линии А правой руки и левой руки в 3 или 13 поле, редукция ладонных трирадиусов правой руки, то диагностируется генетическая предрасположенность к раку молочной железы, при анализе общей предрасположенности к развитию онкологичекских заболеваний учитывается комплекс генетических и негенетических факторов, вероятность развития онкологических заболеваний повышается при наличии: генетической предрасположенности, экологического загрязнения места проживания и места работы, наличии рака у ближайших родственников, вредных привычек - курения и употребления алкоголя, и с увеличением возраста; причем степень риска заболевания раком легких также повышается у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронические неспецифические заболевания легких, туберкулез; степень риска заболевания раком желудка повышается также у мужчин, лиц, имеющих в анамнезе хронический гастрит, язвенную болезнь желудка, часто употребляющих острую и жирную пищу; вероятность заболевания раком молочной железы повышается при наличии в анамнезе хронических гинекологических заболеваний, при увеличении количества искусственных и самопроизвольных абортов, увеличении количества беременностей и уменьшении количества родов, увеличении возраста начала mensis и снижении возраста начала менопаузы.

Имя изобретателя: Якушева Марина Юрьевна (RU), Ползик Евгений Владимирович (RU), Казанцев Владимир Сергеевич (RU), Лежнин Владимир Леонидович (RU)
Имя патентообладателя: Якушева Марина Юрьевна (RU), Ползик Евгений Владимирович (RU), Казанцев Владимир Сергеевич (RU), Лежнин Владимир Леонидович (RU)
Почтовый адрес для переписки: 620103, г.Екатеринбург, ОПС-103, а/я 13, Д.П. Дудину
Дата начала отсчета действия патента: 25.06.2010

Разместил статью: admin
Дата публикации:  10-02-2013, 16:06

html-cсылка на публикацию		⇩ Разместил статью ⇩ Фомин Дмитрий Владимирович  Его публикации  Нужна регистрация Отправить сообщение
BB-cсылка на публикацию
Прямая ссылка на публикацию

Огромное Спасибо за Ваш вклад в развитие отечественной науки и техники!