Способ прогнозирования болезни трансплантата после сквозной кератопластики

Общеизвестным методом борьбы за жизнь любого трансплантата является (местное и системное) применение иммуносупрессивной терапии, включающей как глюкокортикоиды, так и селективные препараты (циклоспорин A, FK506). Обратной стороной такой тактики ведения больных может быть реактивация вирусных инфекций при кератопластике, в этом аспекте в литературе рассматриваются прежде всего вирусы простого герпеса - ВПГ1 и ВПГ2. Информация о роли ВГЧ-6 в литературе практически отсутствует и непосредственно к кератопластике не относится. Реактивацию ВГЧ-6 описывают в «большой трансплантологии» внутренних органов (почки, печень). Однако критерии для назначения противовирусных средств не разработаны.

В связи с этим нами были проведены параллельные исследования по выявлению ДНК-вирусов группы герпеса в крови и роговице реципиентов и серологических маркеров этих вирусов (антитела разных классов в сыворотке). По нашим наблюдениям, наиболее неблагоприятным оказалось выявление вирусной ДНК (в роговице и/или в крови) при отсутствии противовирусных IgG-антител. На фоне высоких уровней защитных антител риск развития реакции отторжения трансплантата снижался, что говорит о том, что наибольшее прогностическое значение имеет выявление вирусных ДНК в роговице в сочетании с определенным уровнем IgG-антител в сыворотке. Целенаправленный анализ исходов кератопластики у пациентов с различными уровнями IgG-антител к ВГЧ-6 показал, что при уровне IgG-антител ниже 0.3 мкг/л у большинства развивается болезнь трансплантата. Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность разработки этиопатогенетических подходов к послеоперационному ведению пациентов «высокого риска» отторжения трансплантата со своевременным назначением противовирусных препаратов. Технический результат достигается за счет исследования фрагментов роговицы реципиента для выявления ДНК-вируса и параллельной серодиагностики (ИФА) IgG-антител.

Наличие ДНК-вируса без усиления защитных механизмов (IgG) расценивается нами как прогностически неблагоприятный фактор, требующий медикаментозной коррекции.

Способ прогнозирования болезни трансплантата после сквозной кератопластики осуществляется следующим образом

У пациента во время кератопластики иссекают фрагмент собственной роговицы. ДНК из фрагментов роговицы реципиента выделяют, например, с использованием набора NucleoSpin^® (Macherey-Nagel, Германия). Роговицы лизируют в буфере (200 мкл) с протеиназой К - термостатирование 1,5 часа при 55°C и затем 20 мин при 95°C. Затем центрифугирование 5 мин при 12,5 тыс. об/мин. Определение ВГЧ6-вирусной ДНК в образцах проводят методом гнездовой ПЦР.

Показателем эффективности выделения ДНК служат результаты определения человеческого гена GAPDH методом реал-тайм ПЦР, что позволяет контролировать возможное ингибирование реакции, правильность забора клинической пробы, эффективность выделения ДНК на стадии пробоподготовки. Реакцию проводят в термоциклере ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), гнездовую ПЦР на герпесвирусы проводят, в частности, в термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия). Программы первого и второго этапов гнездовой ПЦР были одинаковы. Праймеры синтезировали в ЗАО «Евроген РУ» (Россия), зонд синтезировали в ООО «ДНК-Синтез» (Россия). В каждой постановке присутствовали контрольные положительные и отрицательные образцы. Анализ продуктов амплификации проводят электрофорезом в 1,5% агарозном геле с EtBr. Противовирусные антитела выявляют с помощью иммуноферментного анализа (например, тест-система Векто HHV-6-IgG, РУ  ФСР 2011/09853, Вектор-Бест, Россия).

Результаты оценивают следующим образом: наличие ДНК-вируса в роговице реципиента в сочетании с высокими титрами IgG-антител к ВГЧ-6 свидетельствует о высокой степени противовирусной защиты и, следовательно, о благоприятном прогнозе (прозрачный трансплантат) без проведения специфической терапии; тогда как наличие (ДНК) ВЧГ-6 в роговице в сочетании с титрами IgG-антител ниже 0,3 мкг/л в сыворотке крови является плохим прогностическим признаком и показанием для проведения специфической противовирусной терапии.

Пример 1. Больная В., 56 лет, диагноз: OD - поствоспалительное помутнение роговицы; OS - здоров. Проведена сквозная кератопластика на OD. В день операции проведена серодиагностика уровня IgG к ВГЧ-6 и ПРЦ-исследование удаленного фрагмента роговицы реципиента на ДНК ВГЧ-6. ПЦР-исследование фрагмента роговицы выявило наличие ДНК ВГЧ-6, а серодиагностика - высокий уровень IgG к ВГЧ-6 (3,5 мкг/л). Специфическая противовирусная терапия в данном случае не показана, так как уровень «защитных» IgG высокий. Полная эпителизация трансплантата на фоне репаративной терапии отмечалась на 7 сутки, отдаленные результаты (12 месяцев) показали, что трансплантат прозрачный, неоваскуляризации нет. Это свидетельствует о том, что полученные показатели действительно явились прогностическими.

Пример 2. Больной В., 45 лет, диагноз: OS - поствоспалительное помутнение роговицы. Проведена сквозная кератопластика на OS. В день операции проведена серодиагностика уровня IgG к ВГЧ-6 и ПЦР-исследование удаленного фрагмента роговицы реципиента. ПЦР-исследование фрагмента роговицы выявило наличие ДНК ВГЧ-6, а серодиагностика - отсутствие IgG к ВГЧ-6. Данное сочетание было расценено как прогностически неблагоприятное. В послеоперационном периоде развилась эрозия с последующим помутнением трансплантата.

Таким образом, полученный способ позволяет прогнозировать возможный исход кератопластики, основываясь на данных ПЦР-диагностики вирусной (ВГЧ-6) ДНК в роговице реципиента и уровне «защитных» IgG антител в ВГЧ-6 в сыворотке крови.

Формула изобретения

Способ прогнозирования болезни трансплантата после сквозной кератопластики, отличающийся тем, что после иссечения роговицы реципиента определяют в ней наличие ДНК вируса герпеса человека - 6 (ВГЧ-6) и параллельно в сыворотке крови - уровень иммуноглобулинов класса G (IgG) к ВГЧ-6 и при наличии ДНК ВГЧ-6 в роговице и уровне IgG ниже 0,3 мкг/л в сыворотке прогнозируют развитие болезни трансплантата.

Имя изобретателя: Слепова Ольга Семеновна (RU), Миронкова Елена Александровна (RU), Макаров Павел Васильевич (RU), Кугушева Анна Эдуардовна (RU), Демкин Владимир Витальевич (RU), Садохина Татьяна Сергеевна (RU)
Имя патентообладателя: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Почтовый адрес для переписки: 105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, МНИИ ГБ им. Гельмгольца, отдел информации
Дата начала отсчета действия патента: 11.11.2011

Разместил статью: admin
Дата публикации:  10-01-2013, 16:03

html-cсылка на публикацию		⇩ Разместил статью ⇩ Фомин Дмитрий Владимирович  Его публикации  Нужна регистрация Отправить сообщение
BB-cсылка на публикацию
Прямая ссылка на публикацию

Огромное Спасибо за Ваш вклад в развитие отечественной науки и техники!